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十二指肠贾第虫（Giardia duodenalis）,过去称为蓝氏贾第虫,简称贾第虫,作为人兽共患寄生虫,主要寄生在人和某些哺乳动物的小肠内,引起以腹泻为主要特征的贾第虫病,严重危害人体以及其他动物的健康。目前控制贾第虫病还是主要依靠抗贾第虫药的使用,如:甲硝唑、替硝唑等。但频繁使用抗贾第虫药物会产生耐药性及明显的毒副作用。目前尚无理想的药物或疫苗,其原因主要是对贾第虫细胞的分子生物学特性及周期调节机制缺乏了解。由于贾第虫可以在体外反复传代呈现“永生化”,而永生化主要依靠端粒酶反复复制端粒重复序列,维持长度,因此研究其端粒相关功能具有十分重要的现实意义。贾第虫的端粒结构作为一种特殊的DNA-蛋白质复合物,存在于细胞核中染色体的末端,主要依靠端粒酶的调节行使其功能,使其具有“永生化”的特点。贾第虫的端粒酶主要包括端粒酶RNA（TR）、端粒酶逆转录酶（TERT）和端粒酶相关蛋白（TAP）三部分。其中,TERT蛋白主要包括两个结构域:端粒酶RNA结合功能域（TRBD）和逆转录酶功能域（RT）。目前端粒酶互作蛋白方面的研究报导相对较少。通过分离和鉴定贾第虫端粒酶TRBD互作蛋白,并分析互作蛋白的功能,有利于揭示贾第虫细胞和分子生物学特性以及端粒酶活性、细胞周期调节等机制。此外,由于贾第虫作为模式生物,进化地位处在原核生物向真核生物过渡的中间环节,具有重要的进化生物学研究价值,因而成为重要的人兽共患原虫研究对象。但目前关于贾第虫的双核所含基因是否相同仍很不清楚,研究端粒酶互作蛋白的共定位对贾第虫的进化特性以及“双核”性的相关研究具有重要意义。本研究以贾第虫端粒酶逆转录酶的端粒酶RNA结合功能域（TRBD）为诱饵,首先对TRBD的互作蛋白进行筛选及验证,并对互作结构域进行鉴定,其次通过SNAP互补实验进行共定位分析,确定其蛋白互作是否发生在“双核”上,然后通过生物信息学方法预测出ZFD蛋白的互作蛋白并进行验证,最后确定ZFD蛋白的功能,分析其对虫体繁殖、端粒酶活性及端粒长度的影响。以期更好的为研究贾第虫端粒的调控机制及细胞分子生物学特性等方面提供新思路。具体研究内容如下:十二指肠贾第虫TRBD蛋白的互作蛋白筛选:本研究首先对十二指肠贾第虫的酵母双杂交文库进行鉴定,确定文库质量。然后通过酵母双杂交筛选,初步鉴定TRBD蛋白与3个阳性克隆。由于贾第虫锌脂蛋白在贾第虫中的作用未见报道,本研究选取锌指蛋白ZFD（GL5080320802）进行后续研究。TRBD蛋白与ZFD蛋白的互作及结构域确定:构建原核表达载体,将TRBD蛋白与ZFD蛋白表达及纯化后共孵育,通过GST pull-down验证了两种蛋白在体外具有相互作用。同时构建真核表达质粒,转染293T细胞,免疫共沉淀验证了TRBD蛋白与ZFD蛋白在真核细胞内具有相互作用。此外,本研究通过构建293T细胞SNAP-tag真核表达载体,将载体转染293T细胞,激光共聚焦显示TRBD与ZFD蛋白可以在293T细胞内相互作用,且蛋白共定位在细胞核上。为了明确TRBD蛋白与ZFD蛋白之间的具体互作结构域,研究将ZFD蛋白拆分成两个结构域,分别于TRBD进行互作分析。GST pull-down结果显示,ZFD蛋白的N端结构域能够与TRBD相互作用,提示了互作蛋白的具体互作位点。TRBD与ZFD蛋白在贾第虫体内的共定位:构建贾第虫SNAP-tag真核表达载体。将载体转染贾第虫后,激光共聚焦显示TRBD与ZFD蛋白可以在贾第虫滋养体内相互作用,且蛋白共定位在细胞核上。ZFD的互作蛋白预测及验证:在明确ZFD确实为TRBD互作蛋白的基础上,为了明确ZFD互作蛋白,将ZFD进行分子模拟分析。结果显示,ZFD分子式为:C 923 H 1438 N 274 O 295 S 15,相对分子质量为21.6KD,等电点为6.70;ZFD蛋白的脂溶指数为54.61,预测该蛋白为亲水性蛋白。此外,通过ZFD结构分析可能与GSB4558蛋白互作。因此,本研究构建了原核表达载体,将TRBD蛋白与ZFD蛋白表达及纯化后共孵育,通过GST pull-down验证了蛋白之间的相互作用。从而为深入研究贾第虫端粒相关蛋白的相互作用网络打下了良好的实验基础。ZFD蛋白功能分析:按照锤头状核酶设计原理,首先设计ZFD序列的核酶Ham-ZFD并确定其核酶体外切割效率,然后将核酶转入虫体。结果显示核酶的转入明显抑制了虫体的繁殖、降低了端粒酶活性,缩短了端粒的长度。提示ZFD蛋白可能通过正调节端粒酶活性及端粒长度,影响虫体的生长繁殖。综上所述,本研究筛选出了ZFD等3个TRBD阳性克隆,并通过GST pull-down及Co-IP进行了验证TRBD与ZFD蛋白的相互作用。另外,本研究还通过亚细胞定位分析,明确了TRBD与ZFD蛋白的互作位点贾第虫滋养体的“双等核”上。此外,ZFD的互作蛋白进行了预测及验证。最后,本研究分析了ZFD的蛋白功能,结果显示核酶的转入明显抑制了虫体的繁殖、降低了端粒酶活性,缩短了端粒的长度。提示ZFD蛋白可能通过正调节端粒酶活性及端粒长度,影响虫体的生长繁殖。本研究在分子水平上丰富了贾第虫的端粒相关蛋白的研究,为深入研究贾第虫端粒相关蛋白的相互作用网络打下了良好的实验基础,并对深入研究贾第虫特异性药物和疫苗作用靶位等提供研究方向。