原发性肝细胞癌是全世界最常见恶性肿瘤之一,其死亡率在恶性肿瘤中位于胃癌、食道癌之后居第三位。我国是原发性肝细胞癌的高发区,我国每年死于肝癌的人数,约占全世界肝癌死亡人数的50%。近20年来,虽我国的肝癌治疗水平取得了长足的进步,但肝癌的发病率和死亡率仍位于癌症中第二位。SIRT3是沉默信息调节因子家族(Sirtuins, silent information regulator)中一员,线粒体内主要的去乙酰化酶,近年新发现的一种抑癌基因,但当前,对于SIRT3在肝癌发病过程中发挥的作用尚无相关研究报道。因此,进一步研究揭示SIRT3在肝癌中的作用和功能,为肝癌诊断及治疗提供依据有着十分重要的意义。本研究分为三部分：目的观察SIFRT3在原发性肝细胞癌中的表达,并分析其在肝癌中表达的意义。方法采用免疫组织化学和Western-blotting实验方法检测在32例原发性肝细胞癌的癌和癌旁组织及10例正常肝组织中表达情况,并分析及意义。结果1、免疫组化实验结果在32例肝癌石蜡组织标本中,共有19例呈阳性表达,但无强阳性表达,SIRT3的阳性表达率为59.38%(19/32)；癌旁肝硬化组织中共例31阳性表达,SIRT3的阳性表达率为96.88%(31/32),其中18例呈强阳性表达；而10例正常肝组织中全部呈阳性表达,其阳性表达率为100.0%(10/10),并有7例呈强阳性表达。肝癌组织与癌旁肝硬化、正常肝组织相比较,SIRT3阳性表达率及阳性评分均数差异均有统计学意义(P<0.05)。而癌旁组织与正常肝组织之间差异无统计学意义(P>0.05)2、Western-blotting实验结果在32例肝癌组织中SIRT3蛋白的表达量(SIRT3/GAPDH)明显低于癌旁肝硬化组织的蛋白表达量及正常肝组织的蛋白表达量,差异均具有统计学意义(P<0.05)。虽然癌旁组织中的SIRT3蛋白表达水平略低于正常肝组织,但差异无统计学意义(P>0.05)。3、肝癌组织中SIRT3蛋白表达量与临床病例资料的关系结果32例肝癌组织中SIRT3的表达水平与性别、年龄、AFP值、肿瘤大小及有无包膜之间的差异无统计学意义(P>0.05)；与门静脉癌栓、肿瘤细胞的分化程度之间的差异均具有统计学意义(P<0.05)结论在正常肝组织、肝癌癌旁组织中SIRT3呈高表达；在肝癌组织中SIRT3呈低表达或缺失提示在肝癌的发生发展过程中发挥了一定的作用。目的构建SIRT3真核表达载体并转染HepG2细胞株,确定下步试验的最佳时间点。方法以临床获取的正常肝组织mRNA为模板,通过RT-PCR方法获得SIRT3基因全长序列,将其克隆连接pZsGreen-c1载体,进行序列、双酶切鉴定。采用脂质体转染技术将重组质粒转染至肝癌HepG2细胞株中。将细胞株分为三组：pZsGreen-c1-SIRT3HepG-2组(实验组)、pZsGreen-c1HepG2组(实验对照组)和HepG2细胞(空白对照组),通过Western-blotting试验方法检测转染0h、24h、48h、72h、96h后,各组细胞中SIRT3的表达情况,并确定下一步最佳实验时间。结果成功构建了真核表达载体pZsGreen-c1-SIRT3,并将其转染至HepG2细胞株。Western-blotting检测结果显示：转染48h后pZsGreen-c1-SIRT3HepG2细胞株中SIRT3蛋白的表达水平明显高于pZsGreen-c1HepG2组和HepG2组,差异有统计学意义(P<0.05),转染后72小时为下一步实验的实验时间点。结论成功构建pZsGreen-c1-SIRT3的真核表达质粒并鉴定。目的观察pZsGreen-c1-SIRT3HepG2细胞株的增殖和调亡,并研究其初步作用机制。方法采用RT-PCR、Western-blotting实验方法检测HepG2、L02细胞株的SIRT3mRNA及蛋白的表达水平的表达；采用MTT实验观察pZsGreen-c1-SIRT3HepG2、pZsGreen-c1HepG2和HepG2三组细胞株的生长、增殖；AnnexinV/PI双标测三组细胞株的凋亡率。采用RT-PCR和Western-blotting实验方法检测pZsGreen-c1-SIRT3HepG2细胞株、pZsGreen-c1HepG2细胞株和HepG2细胞株中SIRT3、Fas、Bax、P53mRNA及蛋白的表达水平和WST-1方法检测三组细胞株中MnSOD含量。结果1、RT-PCR和Western-blotting实验L02细胞株中SIRT3表达量较HepG2细胞株的表达水平明显增高,两组细胞株比较之间差异有统计学意义(P<0.05)。2、MTT实验结果pZsGreen-c1-SIRT3HepG2、pZsGren-c1HepG2和HepG2三组细胞株的OD值随培养时间延长,OD值逐渐升高,呈时间依赖性,C组与A、B组细胞株培养48小时后不同时间点OD值、抑制率之间比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。三组细株培养48小时候不同时间点的OD值及抑制率之间比较的结果提示pZsGreen-c1HepG2细胞株生长受到了明显的抑制,且pZsGreen-c1-SIRT3HepG2细胞株培养48小时后的抑制率随培养时间的延长,而抑制率升高,呈时间依赖性3、AnnexinV/PI双标测三组细胞株凋亡率比较：pZsGreen-c1-SIRT3HepG2细胞组早期和晚期凋亡细胞期细胞,相对于pZsGreen-c1HepG2和HepG2两组细胞株都明显增多,具有显著性差异(P<0.01)。4、RT-PCR和Western-blotting实验pZsGreen-c1HepG2和HepG2两组细胞株中SIRT3、p53、Bax、Fas表达量二者之间无显著性差异(P>0.05), pZsGreen-c1-SIRT3HepG2细胞组中SIRT3、p53、Bax、Fas表达水平明显增加,它们的表达水平与pZsGreen-c1HepG2和HepG2两组细胞株比较之间显著性差异(P<0.01)。5、WST-1法检测了三组细胞株中MnSOD的含量,其中pZsGreen-cl HepG2和HepG2两组细胞株中MnSOD含量二者之间无显著差异性(P>0.01)；pZsGreen-c1-SIRT3HepG2细胞组中MnSOD的含量较其他组的含量明显增加,与pZsGreen-c1HepG2和HepG2两组细胞株比较之间有显著性差异(P<0.01)。结论1、pZsGreen-c1-SIRT3具有抑制HepG2细胞株的生长增殖,诱导HepG2细胞株的凋亡的作用；2、其可能的作用机制是SIRT3高表达上调MnSOD和p53的表达水平,及MnSOD上调Bax、Fas来诱导细胞凋亡。总结论1、在正常肝组织、肝癌癌旁组织中SIRT3呈高表达,在肝癌组织中SIRT3呈低表达或缺失；提示SIRT3在肝癌的发生发展过程中发挥了一定的作用；2、成功构建pZsGreen-c1-SIRT3的真核表达质粒并鉴定；3.pZsGreen-c1-SIRT3具有抑制HepG2细胞株的生长增殖,诱导HepG2细胞株的凋亡作用；4、其可能作用机制是SIRT3高表达上调MnSOD和p53的表达水平,MnSOD上调Bax、Fas来诱导HepG2细胞株凋亡。