一、研究背景和目的新生儿细菌性脑膜炎是一种危重且极为常见的中枢神经系统感染,病死率和后遗症发生率较高,30%-50%的患者多伴有神经系统后遗症如脑瘫、癫痫等。其中大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli) K1株是引起新生儿菌血症和脑膜炎的重要革兰氏阴性菌,定植并黏附和侵袭肠黏膜是E.coli K1株引起血源性感染的关键。在新生儿时期,肠道定植的E.coli K1株极易易位于母亲的阴道,使新生儿在通过产道时被感染。E.coli K1株一经定植,0.5%可发生肠道侵袭性定位转移而入血,并穿过血脑屏障而引发脑膜炎。因此,在E.coli K1株穿透肠上皮入血发病的四个关键：高水平菌血症、对脑微血管内皮细胞的侵袭、受体介导胞吞转运及相关信号转导及活菌横穿血脑屏障中作出有效干预,成为预防和治疗脑膜炎和菌血症的重要举措之一。黏蛋白(mucin,简称Muc)作为黏液凝胶的主要成分,是一种由位于黏膜表面或隐窝内特化的杯状细胞所合成和分泌的大分子糖蛋白,广泛存在于胃肠道、呼吸道、生殖道等多种上皮组织中。根据其核心蛋白(apomucin)的不同,迄今已确定21种黏蛋白基因(MUC1～MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6～MUC21)[5],其主要功能涉及抗原呈递、细胞间黏附、信号传导及免疫调节等方面。其中,Muc2基因是美国学者Gum等于1989年自人小肠黏膜的cDNA表达文库中克隆得到的一种黏蛋白核心肽基因,定位在染色体11p15.3～15.5上,是编译分泌型黏蛋白Mucin2 (Muc2)的主要基因。黏蛋白Muc2是主要的回结肠黏蛋白,也是构成肠道黏液层的主要成分,兼具组织特异性和细胞特异性。正常时仅在小肠和空肠的杯状细胞中有表达且表达量较低,可在肠腔的上皮表面形成一层黏液层发挥润滑和拮抗致病菌的黏附和侵袭的作用[7]。R.Mack等已证实黏蛋白由上皮细胞分泌,可阻挡肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic Escherichia coli, EPEC)接触肠上皮细胞,避免EPEC等黏附肠上皮细胞造成感染。Chang CY等发现该黏蛋白不仅在肠化生黏膜中出现过表达,在多种上皮来源的肠道疾病和肿瘤中亦出现结构和功能质或量的改变。益生菌是一类通过改善宿主肠道微生物菌群的平衡而发挥作用的活性微生物,对改善肠道菌群结构、抑制病原菌侵袭、提高机体免疫力等方面有重要作用。国内外研究证实,益生菌可有效黏附于肠道上皮细胞,通过自身及产生代谢物和抑制物排斥致病菌。益生菌制剂抑制病原微生物黏附肠道上皮细胞多由肠道黏液素Muc2、Muc3的表达作为媒介,通过加强肠内黏液素的分泌来产生空间障碍或是模仿上皮细胞的细菌结合位点进行竞争抑制。近年来我们对如何激发高效的肠道黏膜免疫应答进行了研究,发现在强化肠道屏障功能方面较有成效的长双歧杆菌(Bifidobacterium)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的肠道益生菌组合可显著抑制E.coliK1株黏附与侵袭新生大鼠肠道,从而降低脑膜炎发生率。与上述三种益生菌相比,鼠李糖乳杆菌GG (Lactobacillus rhamnosus GG, LGG)株作为首批获得中国卫生部正式批准的新资源食品,能更显著调节胃肠道菌群平衡,存活并稳定定殖人体肠道,但在脑膜炎相关性研究中却应用极少。因此,Muc2的表达和LGG株抑制致病菌对肠上皮黏附与侵袭是否相关将是未来数年预防性益生菌治疗的一大研究热点。识别靶点依靠PAM区(Protospacer-Adjacent motif)和靠近PAM的11bp种子序列完全保守的CRISPR/Cas9系统由一类广泛存在于细菌和古细菌体内的高度保守获得性免疫系统改造而成,是自2013年面世以来,一项极具革命性的靶向基因修饰技术。其中向导RNA (singleguide RNA,sgRNA)和核酸酶是整个系统发挥活性的核心。经历CRISPR高度可变间隔区获得、CRISPR基因座表达(包括pre-crRNA转录和后续成熟加工)、扫描外源DNA寻找和结合靶序列、crRNA、tracrRNA、Cas9结合形成的核糖核蛋白复合物在配对的特定位置切割外源DNA等阶段对外来入侵的噬菌体或是遗传物质进行干扰。相比于ZFN(Zine finger endonuclease)和TALEN (Transcription activator-like effector nuclease), CRISPR/Cas9虽然因面世时间较短,仍存在不少有待研究的部分。但仍然以其构建简单,特异性高,精确的切口酶活性拥有着广阔的应用前景。为进一步探讨益生菌加强肠屏障功能的机制,分析比较益生菌单独防治和调节黏蛋白Muc2辅助治疗肠道细菌性感染的异同,本研究利用新型基因修饰技术CRISPR/Cas9将目的sgRNA寡核苷酸双链插入酶切后的lenticrisprv2质粒载体中,转染野生型Ht29细胞干扰Muc2基因表达,构建Muc2基因表达下调的人结肠癌Ht29细胞模型,以了解黏蛋白Muc2与LGG抑制E.coli K1株E44黏附和侵袭肠屏障之间的关系。二、研究方法1、Lenticrisprv2-sgRNA质粒表达载体的构建与鉴定查询NCBI基因库中人Muc2基因序列,并根据CRISPR/Cas9系统中sgRNA对20个碱基靶序列DNA识别要求靶序列后紧跟一个-NGG(N代表ATGC中任意一个碱基)的PAM序列等设计原则,筛选特异性序列为变异抑制靶点,利用sgRNA设计网站(http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html)设计合成4条Muc2 Oligo单链,序列见表1,斜体处为BsmBI酶切位点。将sgRNA寡核苷酸单链退火形成双链DNA;用BsmBI限制性内切酶酶切lenticrisprv2质粒；连接酶切后的lenticrisprv2质粒和线性化sgRNA,连接体系：2μl BasBI digested plasmid;6μl vector;1μl T4 DNA连接酶;1μl连接缓冲液;10μl去离子水,16℃连接12h构建lenticrisprv2-sgRNA,连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,阳性重组体鉴定后小提质粒并测序验证。相应包装质粒pCMV-dR8.2 dvpr和pCMV-VSV-G的质粒也一并提取、低温浓缩和切胶回收。2、慢病毒载体的构建及转染人结肠癌Ht29细胞采用磷酸钙转染法,按一定比例混合plenticrisprv2-sgRNA、pCMV-dR8.2dvpr和pCMV-VSV-G,转染HEK293T细胞。使用PEG8000收集纯化慢病毒,以备转染人结肠癌细胞Ht29及筛选稳定株。转染前48h将Ht29细胞接种于24孔板,部分细胞按不同浓度加入含Puromycin完全培养液,浓度梯度分别为0μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、6μg/ml、7μg/ml,5d后观察其死亡的方式、形态、时间,取培养板中细胞全部死亡的最低浓度为Puromycin筛选的工作浓度；加入收集的病毒液感染Ht29细胞,72h后用最低Puromycin筛选工作浓度筛选病毒感染阳性细胞,以备验证干扰效率。3、蛋白免疫印迹法检测Muc2基因干扰效率取对数生长期的单层培养细胞,提取细胞总蛋白并以BCA法进行蛋白定量。取20μg蛋白样品进行SDS-PAGE聚丙烯胺凝胶电泳。转PVDF膜,5%的脱脂牛奶-TBST溶液中室温封闭1h,PVDF膜在稀释的一抗中,4℃摇荡孵育过夜。取出PVDF膜,TBST洗膜3次,每次5min。将PVDF膜与稀释的二抗室温下摇荡孵育1h,TBST洗膜3次,每次5min。显影液滴加于PVDF膜上,化学发光成像仪成像。4、MTT比色法和细胞计数法检测细胞活力和生长情况为检测细胞活力和生长情况,藉此选择适当的细胞接种浓度和培养时间。取对数生长期的单层培养Ht29/KD-MUC2-Ht29细胞,消化后重悬并计数。按104cells/ml接种至24孔板。每24h取出3孔细胞进行血球计数板计数。以细胞数为纵轴,培养时间为横轴绘制细胞生长曲线；确定细胞接种浓度和培养时间后,取对数生长期的单层Ht29/KD-MUC2-Ht29细胞,消化后离心,重悬并计数,调整细胞浓度为104cells/ml后以MTT法分别在24、48、72、96h时测定细胞生长曲线。以OD值为纵轴,培养时间为横轴绘制细胞生长曲线。实验重复三次。5、黏附实验实验前48小时用Ht29铺24孔板106cell/孔,将实验用E44菌株以BHI培养基稀释为106CFU/ml备用,实验用LGG菌株以MRS培养基稀释为107CFU/ml备用,以下列各种条件刺激单层Ht29.E44+LGG处理组按(107CFU LGG+106CFUE44)/孔加入培养有Ht29细胞的24孔细胞培养板中,孵育3h,E44处理组用等体积新鲜完全培养液代替LGG。0.5% Tri ton X-100 200μl/孔孵育10min,倍比稀释后涂布含利福平的LB琼脂平板,24h后计数菌落数。6、侵袭实验实验前48小时用Ht29铺24孔板106ce11/孔,将实验用E44菌株以BHI培养基稀释为106CFU/ml备用,实验用LGG菌株以MRS培养基稀释为107CFU/ml备用,以下列各种条件刺激单层Ht29:E44+LGG处理组按(107CFU LGG+106CFUE44)/孔加入培养有Ht29细胞的24孔细胞培养板中,孵育3h,E44处理组用等体积新鲜完全培养液代替LGG。换入新鲜完全培养液(含100gg/ml庆大霉素)孵育1h。0.5%TritonX-100 200μl/孔孵育10min,倍比稀释后涂布含利福平琼脂平板,24h后计数菌落数。7、检测益生菌诱导的乳鼠肠道Muc2基因的表达取2日龄SD乳鼠共12只,随机分成益生菌LGG组、益生菌LGG+致病菌E44组、致病菌E44组和空白对照组。1-4d:益生菌LGG组、益生菌LGG+致病菌E44组乳鼠灌胃LGG(106CFU/只),致病菌E44组和空白对照组乳鼠灌胃等体积无菌PBS；5-7d:对益生菌LGG+致病菌E44组乳鼠同时灌胃给予LGG和E44(106CFU/只),致病菌E44组则灌胃E44(106CFU/只),空白对照组仍灌胃等体积无菌PBS；8d;取其结肠;RT-PCR半定量法检测MUC2基因表达。Trizol法提取组织RNA,逆转录合成cDNA,取3μg总RNA进行PCR反应,以GAPDH为内参。PCR反应引物如下：MUC2-F:ACAAAAACCCCAGCAACAAG;MUC2-R:GAAGTCGGGACAGGTGATGT;GAPDH-F:GAGACAGAAACTTTCGAAGC;GAPDH-R:GAAGTCTGTGGTATCCAATCC按照95℃5min,95℃30s,55℃30s,72℃30s共30个循环,72℃5min充分延伸。取5μ1延伸产物进行2%琼脂糖凝胶电泳鉴定和凝胶电泳灰度分析。三、结果1、重组sgRNA质粒表达载体菌落PCR鉴定和DNA测序取10个菌落,作好标记,放入100℃水浴中,煮沸2分钟以制备PCR模板。20μlPCR体系： 2μl模板;1μl上游引物;1μl下游引物;10μl rTaq;6μl去离子水；PCR条件：95℃ 5min预变性→95℃30s变性→56℃ 30s退火→72℃ 30s延伸→72℃ 5min再延伸→4℃,变性退火延伸共30循环。菌落PCR结果显示,所有重组体均为阳性重组质粒,从每组平板中挑选两个典型克隆进行测序鉴定。经引物测序后,测序结果和设计的sgRNA碱基序列一致,证明目的sgRNA寡核苷酸双链成功插入酶切后的lenticrisprv2中且序列正确,构建了后续实验所需的重组质粒。2、Muc2沉默后其蛋白表达水平的变化稳定抑制Muc2表达的细胞株筛选成功；经细胞总蛋白提取和蛋白定量后,蛋白免疫印迹法检测基因沉默后Muc2蛋白的表达,取得SDS-PAGE结果并进行目的基因与内参照条带光密度分析,与空白对照组相比,其表达水平明显降低,抑制率可达81%(P<0.01)。3、Muc2沉默对细胞活性和生长情况没有影响细胞计数法和MTT法测定Muc2表达下调的Ht29细胞与正常HT29细胞的生长曲线和汇合率曲线,结果显示Muc2缺失前后两种细胞的活性和生长情况良好,生长曲线和汇合率曲线没有明显差异。估算正常Ht29细胞群体的倍增时间约为26h,KD-MUC2-Ht29细胞的倍增时间约为24h。4、Muc2沉默降低益生菌抑制E44黏附的能力体外竞争性排斥分析Muc2沉默在益生菌拮抗E44黏附野生型Ht29细胞中的调节作用。将E44处理组黏附率假定为100%标化LGG与E44共孵育时E44的相对黏附率(相对黏附率%=(LGG+E44处理组的菌落数/E44处理组的菌落数)×100%)。Muc2基因表达下调前,E44相对黏附率为15.38%,益生菌LGG显著抑制致病菌E44黏附侵袭Ht29细胞(P<0.01);Muc2基因沉默后,E44相对黏附率为72.23%,益生菌LGG的干扰作用明显降低(P<0.01)5、Muc2沉默下调益生菌对E.coli K1株E44侵袭能力的抑制作用以E44处理组侵袭率假定为100%标化LGG与E44共孵育时E44的相对侵袭率(相对侵袭率%=(LGG+E44处理组的菌落数/E44处理组的菌落数)×100%)。Muc2基因沉默前,E44相对侵袭率为25.13%,益生菌LGG显著抑制致病菌E44黏附侵袭Ht29细胞(P<0.01)：Muc2基因沉默后,E44相对侵袭率为81.49%,益生菌LGG的干扰作用明显下调(P<0.01)6、益生菌可显著诱导小鼠肠道MUC2表达的上调而拮抗致病菌12只SD乳鼠经7d给药后,提取结肠组织总RNA,采用RT-PCR半定量法检测乳鼠肠道Muc2基因表达情况。体内实验结果佐证了黏蛋白Muc2在益生菌抑制致病菌黏附侵袭肠屏障中发挥的关键性作用,与空白对照组相比,益生菌组Muc2基因表达明显上升(P<0.01),致病菌组Muc2基因表达显著下调(P<0.01)；与LGG+E44组和E44组的结果作比对,益生菌LGG显著抑制E.coli K1株E44诱导分泌型黏蛋白Muc2基因的表达。(P<0.01)四、统计学分析数据用均数±标准差表示,统计方法采用SPSS 13.0统计软件中的单因素方差分析和t检验方法进行,方差不齐时进行变量转换。P<0.05表示差异有统计学意义。五、结论1、利用CRISP/Cas9可在结肠癌细胞株Ht29中建立完整的△Muc2细胞模型;Lenticrisprv2-sgRNA质粒使Ht29细胞内源性的Muc2在蛋白质水平表达显著下降可达81%,且基因沉默后的细胞生长曲线无明显变化证明该细胞模型是有效的。2、Muc2基因沉默明显降低益生菌对E44黏附和侵袭肠上皮的抑制作用,而益生菌通过上调MUC2的表达亦发挥抑制致病菌对肠上皮损伤的预防作用。