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目的：苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hyroxylase,PAH)基因6 种突变R270G、P275A、F121L、A156P、E183G 和I324N 均为错意突变,是由本科检出并报道的新突变,R408Q 为已报道突变。本实验应用体外表达的方法对这7 种突变进行功能分析,通过检测其mRNA 水平、蛋白水平及酶活性水平的变化和BH4 反应性分析，探讨其突变效应和致病性质，进一步明确基因型和表型之间的关系。
方法：（1）应用体外定点诱变技术构建含有7种突变型PAH cDNA的表达载体，转化感受态大肠杆菌，提取质粒并测序验证。（2）将含有野生型和突变型PAH cDNA的真核表达载体pcDNA3.0瞬时转染COS-7细胞，转染48 h后提取总RNA和总蛋白，应用实时荧光定量PCR法检测mRNA、免疫印记法检测蛋白表达量并进行酶活性分析。以野生型PAH作为参照，计算突变型PAH的mRNA水平和蛋白的相对表达量、残余酶活性。（3）转染后5 h分别更换不含BH4的DMEM培养基和含20 mg/L BH4的DMEM培养基,检测mRNA和蛋白表达量并进行酶活性分析，观察野生型和突变型PAH的BH4反应性。
结果：（1）突变型PAH R270G、P275A、F121L、A156P、E183G、I324N和R408Q 的mRNA 相对表达量分别为野生型的133％，75％，337％，386％,125％,115％和181％；（2）相对于野生型PAH，加入BH4 前后突变型PAH 蛋白相对表达量分别为：R270G ：10.5％→16％, P275A ：56.6％→122.3％, F121L ：54.3％→150.5％, A156P ：8.7％→20.7％,E183G ：8.5％→14％, I324N：67.3％→142.5％，R408Q:85.4％→155.8％；（3）加入BH4 前后突变型PAH 的残余酶活性分别为：R270G :7.7％→19.3％,P275A:27.6％→52.6％,F121L:19.0％→60.9％, A156P:10.4％→14.6％,E183G:9.1％→23.8％,I324N:50.6％→109％, R408Q:40.2％→111.4％。
结论：（1）相对于野生型PAH，突变体R270G、P275A、E183G和I324N的mRNA水平无明显变化，F121L、A156P和R408Q的mRNA水平有明显增加；
（2） Western blot检测发现除突变体R408Q的蛋白表达量无明显改变外，其它6种突变型PAH的蛋白表达量均有不同程度的减低；酶活性测定表明7种突变型PAH的酶活性均有明显降低，证实这7种突变均为引起PAH酶活性降低的致病性突变。（3）通过BH4反应性分析发现加入20 mg/L的BH4后，7种突变型PAH蛋白的表达量均有提高，除突变体A156P的酶活性没有明显改变外，其它6种突变型PAH的酶活性均有提高。