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鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)是鸭传染性浆膜炎(Infectious serositis)的病原体,主要感染家鸭、鸡、火鸡、鹅等家禽,该病的特征病变是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎、干酪样输卵管炎等,已成为目前危害禽类养殖业的主要传染病之一,造成了巨大的经济损失。鸭疫里默氏杆菌血清型复杂,迄今为止,已公认的有21个血清型(1-21型),各血清型之间缺乏有效的交叉保护。临床上通常以病例特征性的症状和解剖的特征病变进行诊断,但是该病与禽致病性大肠杆菌病和禽沙门氏菌病在临床症状和病理变化上很相似,很难进行鉴别诊断。病原菌的分离鉴定为该病的确诊手段,但是其工作程序较为繁琐,因此需要建立一种快速灵敏特异性强的方法以满足临床快速检测诊断的需求。本实验通过制备鸭疫里默氏杆菌免疫原性蛋白GroEL和TbdR的单克隆抗体,建立基于单克隆抗体的胶体金免疫检测试剂盒,以满足快速检测的需要。1鸭疫里默氏杆菌GroEL、TbdR的原核表达及蛋白纯化根据GenBank上发表的鸭疫里默氏杆菌groEL和tbdR的基因序列设计特异性引物,groEL基因(groEL 1629bp)采用全长表达、tbdR基因采用全长和分段(tbdR-A 2472bp,tbdR-B 1020bp,tbdR-C 1335bp,tbdR-D 678bp)表达的方法,以鸭疫里默氏杆菌CH3菌株为模板进行PCR扩增。基因片段定向克隆表达载体pET-28a (+)和pET-30a (+)中,经鉴定后成功构建了重组质粒pET28a-groEL、pET30a-tbdR-A、 pET30a-tbdR-B、pET30a-tbdR-C、pET30a-tbdR-D。重组质粒转入表达宿主菌BL21(DE3), IPTG诱导后pET28a-groEL、pET30a-tbdR-D重组蛋白获得了表达,重组蛋白的分子量分别为60kDa和25kDa,而pET30a-tbdR-A、pET30a-tbdR-B、pET30a-tbdR-C未见表达。重组蛋白GroEL在上清中表达,而TbdR在包涵体中表达,分别进行纯化后,获得了高纯度和高活性的重组蛋白,为单克隆抗体的制备奠定了基础。2鸭疫里默氏杆菌GroEL、TbdR单克隆抗体的制备纯化的重组蛋白作为免疫原对BALB/c小鼠进行免疫,然后取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,用间接ELISA筛选阳性细胞株并进行3次亚克隆后制备小鼠腹水单克隆抗体。共获得稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株4株,其中鸭疫里默氏杆菌GroEL单抗两株,分别命名为1G2B6和1G2F10;鸭疫里默氏杆菌TbdR单抗两株,分别命名为1A12和3F1。腹水单克隆抗体ELISA效价均达到1：102400。Western blot检测结果表明四株单克隆抗体均能与鸭疫里默氏杆菌血清1、2和10型菌株发生特异性结合,而与禽致病性大肠杆菌、沙门氏菌和禽巴氏杆菌菌株无反应性。本研究成功制备了稳定性好、特异性强的鸭疫里默氏杆菌GroEL和TbdR单克隆抗体,为进一步研制基于抗体检测鸭疫里默氏杆菌抗原的试剂盒奠定了基础。3鸭疫里默氏杆菌免疫胶体金试剂盒的研制用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,确定其最适标记抗体的PH和抗体浓度。试验选择最佳的封闭液和硝酸纤维素膜,对纯化的鸭疫里默氏杆菌GroEL和TbdR单克隆抗体进行抗体组合、浓度和反应条件的筛选,以确定最佳的反应体系。本实验最终确定了金标抗体是鸭疫里默氏杆菌GroEL单克隆抗体1G2F10(最适标记pH为8.0,最适标记浓度为3μg/mL), NC膜包被抗体是鸭疫里默氏杆菌GroEL单克隆抗体1G2F10(检测线)和羊抗鼠IgG(质控线)。利用此体系建立的免疫试纸条检测各种菌株,结果显示,该试纸条具有良好的特异性,灵敏度达到1×106CFU。本研究成功制备了鸭疫里默氏杆菌免疫检测试纸条,,可用于细菌体外培养后的快速筛查,为下一步的分离鉴定创造了有利条件,对鸭疫里默氏杆菌的快速诊断起到重要的辅助作用。