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目的:以黄芪多糖、甘草多糖及其复合多糖为研究对象,利用细胞和分子生物学技术,选用小鼠调节性T细胞和人结肠癌HCT-116细胞作为目标细胞,从细胞水平、基因水平和蛋白水平,研究人结肠癌HCT-116细胞对小鼠调节性T细胞分化和相关细胞因子分泌的影响;研究黄芪多糖和甘草多糖分别对与人结肠癌HCT-116细胞共培养前后小鼠调节性T细胞分化和相关细胞因子分泌的影响;研究黄芪甘草复合多糖对共培养后小鼠调节性T细胞分化和相关细胞因子分泌的影响,并对黄芪多糖、甘草多糖和黄芪甘草复合多糖三者对调节性T细胞影响程度进行比较。深入探讨其诱导调节性T细胞分化和抗肿瘤活性的作用机制。方法:1.流式细胞仪检测小鼠调节性T细胞,确定细胞表型。2.CCK-8法检测黄芪多糖、甘草多糖培养24h后小鼠调节性T细胞的存活率,确定药物的无细胞毒浓度范围;在无细胞毒浓度范围内,检测给药72h后小鼠调节性T细胞的存活率,排除给药时间对调节性T细胞存活率的影响;检测给药72h后HCT-116细胞的存活率,排除共培养模型中药物对HCT-116细胞存活率的影响。3.在无细胞毒浓度范围内,Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒检测给药24h后小鼠调节性T细胞的凋亡率,研究药物对细胞凋亡率的影响。4.Transwell小室建立HCT-116细胞和小鼠调节性T细胞体外非接触式共培养模型,流式细胞仪检测共培养前后小鼠调节性T细胞的表型变化;实时荧光定量PCR检测共培养前后小鼠调节性T细胞相关基因Foxp3、IL-10、TGF-βmRNA的表达;酶联免疫吸附剂测定共培养前后小鼠调节性T细胞IL-10、TGF-β的分泌情况,从而研究HCT-116细胞对小鼠调节性T细胞分化和相关细胞因子分泌的影响。5.黄芪多糖、甘草多糖培养24h后,流式细胞仪检测共培养前后小鼠调节性T细胞的表型变化;选取低中高三个浓度的黄芪多糖和甘草多糖,Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测HCT-116细胞的凋亡率;实时荧光定量PCR检测共培养前后小鼠调节性T细胞相关基因Foxp3、IL-10、TGF-βmRNA的表达;酶联免疫吸附剂测定共培养前后小鼠调节性T细胞IL-10、TGF-β的分泌情况,从而研究黄芪多糖和甘草多糖对共培养前后小鼠调节性T细胞的分化和相关细胞因子分泌的影响。6.CCK-8法和Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡法检测由低中高三个浓度的黄芪多糖和甘草多糖,以1:1配成的黄芪甘草复合多糖培养24h后,小鼠调节性T细胞、HCT-116细胞的存活率和凋亡率,排除药物对细胞存活率和凋亡率的影响。7.黄芪甘草复合多糖给药24h,流式细胞仪检测与HCT-116细胞共培养后,小鼠调节性T细胞的表型变化;实时荧光定量PCR检测共培养后小鼠调节性T细胞相关基因Foxp3、IL-10、TGF-βmRNA的表达;酶联免疫吸附剂测定共培养后小鼠调节性T细胞IL-10、TGF-β的分泌情况,从而研究黄芪甘草复合多糖对共培养后小鼠调节性T细胞的分化和相关细胞因子分泌的影响。结果:1.本次实验所用小鼠调节性T细胞的表型为CD4~+CD25~+FOXP3~+CD152~+PD1~±。2.经CCK-8法检测确定,黄芪多糖和甘草多糖对小鼠调节性T细胞的无细胞毒浓度为0-250μg/mL;选取终浓度为0-50μg/mL的药物剂量,结果显示药物对培养72h后的小鼠调节性T细胞和HCT-116细胞的存活率均无影响。3.Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测结果显示,终浓度为0-50μg/mL的黄芪多糖和甘草多糖对给药24h后的小鼠调节性T细胞的凋亡率没有影响。4.流式细胞仪结果表明,共培养后,HCT-116细胞能增强小鼠调节性T细胞相关表型的表达程度,其中CD25位移最为明显,其次是FOXP3、CD4、PD-1、CD152;实时荧光定量PCR显示,人结直肠癌HCT-116细胞上调小鼠调节性T细胞Foxp3、IL-10、TGF-βmRNA的表达,其中IL-10 mRNA表达显著增高(P<0.01),TGF-βmRNA表达增高(P<0.05);酶联免疫吸附剂测定结果表明,人结直肠癌HCT-116细胞增加小鼠调节性T细胞IL-10、TGF-β的分泌,均有显著性差异(P<0.01)。5.经过24h终浓度为0-50μg/mL黄芪多糖和甘草多糖培养后,流式细胞仪测定发现:黄芪多糖和甘草多糖可以降低调节性细胞相关表型的表达,其中CD4的位移最为明显,CD25次之,并且呈浓度依赖性;对于表型Foxp3、PD-1、CD125,有位移的趋势,但均不明显。故后续实验选用的药物终浓度为:10、25、50μg/mL黄芪多糖和甘草多糖,给药时间24h,指标选用CD4和CD25;实时荧光定量PCR进一步测定黄芪多糖和甘草多糖在基因水平上的调控,结果显示:经药物处理后,共培养前后小鼠调节性T细胞Foxp3、IL-10、TGF-βmRNA的表达与未加药组比均有下调。在50μg/mL的药物浓度下,Foxp3、IL-10、TGF-βmRNA的下调与对照组均具有统计学差异(P<0.05);酶联免疫吸附剂测定结果显示:药物在共培养前后均减少小鼠调节性T细胞IL-10、TGF-β的分泌。6.CCK-8和Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡法结果表明,经过终浓度为10、25、50μg/mL的黄芪甘草复合多糖(1:1)培养24h后,对小鼠调节性T细胞、HCT-116细胞的存活率和凋亡率均没有影响。7.从蛋白水平和基因水平的角度,通过流式细胞仪、实时荧光定量PCR、酶联免疫吸附剂检测发现:黄芪甘草复合多糖对调节性T细胞分化的影响程度优于黄芪多糖和甘草多糖,表现在下调CD4、CD25的表达、减少Foxp3、IL-10、TGF-βmRNA的表达和下调IL-10、TGF-β分泌的方面。结论:1.HCT-116细胞可以促进小鼠调节性T细胞的分化,上调细胞表面免疫抑制性分子的表达,使细胞向免疫抑制性分化。2.通过共培养,发现黄芪多糖和甘草多糖通过诱导调节性T细胞的分化,下调免疫抑制分子的表达和相关mRNA的表达,和人结肠癌细胞对小鼠调节性T细胞的作用形成拮抗,从而抑制肿瘤免疫逃逸,参与肿瘤免疫调节。3.黄芪多糖和甘草多糖本身对肿瘤细胞无杀伤作用,其是通过抑制小鼠调节性T细的胞功能参与肿瘤免疫。4.黄芪甘草复合多糖诱导小鼠调节性T细胞向免疫抑制方向分化,且在下调Foxp3、IL-10、TGF-βmRNA的表达和减少IL-10、TGF-β的分泌方面优于黄芪多糖和甘草多糖。综上所述,APS和GP很可能通过下调Tregs免疫抑制性分子的表达而参与体外的免疫调控和抗肿瘤作用,而且联合用药效果优于单独用药,为黄芪多糖和甘草多糖的临床合理使用提供了有力依据。