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蓖麻毒素(Ricin)又称蓖麻毒蛋白,是从大戟科(Euphorbiaceae)植物蓖麻中分离出来Π型核糖体失活蛋白。Ricin是一种致命性毒素,成年人致死量为7mg,被列为最危险的生物恐怖源,受到美国、英国和欧洲各国的高度重视。因此,建立对Ricin的快速、灵敏检测变得尤为重要。ELISA(enzyme-linkedimmunosorbent assay)被国际定为Ricin检测的金标准,然而与其它免疫检测方法一样,ELISA仍存在着灵敏度有限等问题。
BCA(Bio-bar Code Assay)技术于2003年由Mirkin等开发以来,为分子诊断领域,尤其是微量蛋白质检测提供了一个全新的技术平台。该技术检测蛋白的原理是利用标记被检物单抗的磁性微球探针(magnetic microparticles,MMP)、标记被检物多抗和条形码DNA的纳米金探针(nanoparticle,NP),通过常规PCR和荧光定量PCR对“MMP-被检物-NP”复合结构进行检测。通过多次信号放大,检测灵敏度达到常规ELISA方法的106倍。
基于国际Ricin检测技术现状,将高灵敏度的BCA新型分子诊断技术引入到Ricin BCA检测技术研究,本研究主要包括4个部分:
1.纳米金探针的制备与鉴定利用柠檬酸钠还原法制备纳米金(15nm)溶液,并进行光学、透射电子显微镜和紫外分光光度计鉴定,计算纳米金溶液浓度为2.46×10-10mol/L;在最适pH值下,进行Ricin抗A链多克隆抗体的标记,形成纳米金-Ricin多抗复合物,对该复合物进行透射电子显微镜和紫外分光光度计鉴定;纳米金-Ricin多抗复合物形成后进行条形码DNA标记,得到纳米金探针(Nanoparticle probe,NP),并进行形貌和浓度鉴定,纳米金探针浓度为2.15×10-10 mol/L。
2.磁性微球探针的制备与鉴定磁性微球探针的制备是把Ricin单克隆抗体通过共价键标记在活化后的磁性微球表面,在磁场作用下,磷酸盐缓冲液反复洗涤后得到所要的磁性微球探针(MMP),对其进行抗体标记效率和活性鉴定,标记效率是76.2％。
3.Ricin生物条形码检测体系的建立设计条形码DNA链,大小为100bp;设计了特异性TaqMan探针,大小为25bp;两种探针和被检物通过抗原抗体反应制备纳米金颗粒-Ricin-磁性微球探针(NP-Riein-MMP)复合结构,该结构又叫做“三明治结构”。运用常规PCR和荧光定量PCR方法对"NP-Ricin-MMP"复合结构进行检测,并对检测体系进行优化。
4.Ricin生物条形码检测体系的方法学评价灵敏度:把Ricin蛋白梯度稀释,利用建立的两种检测体系进行灵敏度评价,检测结果表明体系的灵敏度均为10-2ag/μl,是ELISA方法的106倍;特异性:利用建立的两种检测体系对Camphorin蛋白和Ebulitins蛋白进行特异性交叉实验,结果证明两种检测体系均具有良好的特异性;稳定性:对制备的两种探针4℃存放不同时间后取样检测,检测结果表明储存90天后的探针对检测结果不会造成任何影响,灵敏度仍为10-2ag/μl;重复性:通过进行批内和批间重复实验,结果表明检测体系具有可重复性,批内、批间CV＜5%,体系重复性良好。
本课题建立的两种检测体系不仅为Ricin快速、灵敏检测提供了一种新的方法,此外,该方法也可应用于对其他类似被检物的检测,如毒素、生物战剂、肿瘤标志物等,该技术具有良好的创新性和前沿性。