【摘 要】
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该研究根据已发表的绵羊种布鲁氏菌国际标准菌株(63/290)Omp25的基因序列,设计了两对特异性引物,以新疆地区绵羊种布鲁氏菌(80/019)菌株的基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反
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该研究根据已发表的绵羊种布鲁氏菌国际标准菌株(63/290)Omp25的基因序列,设计了两对特异性引物,以新疆地区绵羊种布鲁氏菌(80/019)菌株的基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)技术,扩增基因片段,通过T4DNA连接酶将扩增基因片段连接于T克隆载体质粒上,热击法将重组质粒转化到受体菌DH10B中,蓝白斑筛选阳性菌落,酶切鉴定、测序,用NdeⅠ和XhoⅠ同时双酶切重组质粒T-Omp25和原核表达载体质粒PET-28a,通过T4DNA连接酶将目的基因片段克隆入表达载体中,酶切鉴定,利用热击法将重组质粒PET-28a-Omp25转化入BL21(DE<,3>)大肠杆菌中,经过IPTG诱导表达Omp25基因蛋白.结果:通过PCR技术扩增出600bp左右的一条目的基因特异性带,对扩增出的目的基因带测序表明为642个碱基,与国际标准菌株相比其核苷酸序列除有8个碱基不同之外,在3端还多出36个碱基.Omp25基因片段克隆入原核表达载体中,具有正确的读码框和方向性,并在大肠杆菌中表达了Omp25基因蛋白.研究结果表明:以新疆地区绵羊种布鲁氏菌的基因组DNA为模板,成功的克隆Omp25基因,对其基因序列的分析表明,新疆绵羊种布鲁氏菌与国际标准绵羊菌株Omp25基因序列存在明显差异.新疆绵羊种布鲁氏菌可能是绵羊种布鲁氏菌的一个新的生物型.新疆绵羊种布鲁氏菌Omp25基因成功的在大肠杆菌表达,为进一步研究绵羊种布鲁氏菌外膜蛋白的免疫特性及开发基因工程疫苗奠定了基础.
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