近年来的研究结果显示，骨髓中的脂肪细胞含量增加与骨质疏松等骨科疾病的发生有密切关系，并认为除了成骨与破骨的关系以外，骨髓中的脂肪细胞与成骨细胞的平衡在骨质疏松等的发生中同样具有重要作用。骨髓中的脂肪细胞与成骨细胞都来自骨髓中的间质干细胞。骨髓间质干细胞分化具有可塑性，其分化方向可以受到调控，并且分化成熟的成骨细胞或脂肪细胞都可以相互转分化。骨髓间质干细胞成骨成脂肪分化方向的调控的改变，可能是骨质疏松发生的重要原因。已经发现众多传统用于治疗骨质疏松的药物，比如Alendronate，对MSC分化方向的调控有很大作用。目前对于成骨成脂肪分化方向的调控主要集中在分化成脂肪的抑制上。关于间质干细胞分化成脂肪的信号通路和转录因子的研究，将为临床治疗骨质疏松等骨代谢疾病提供良好的基础。　　 关于成脂肪分化的转录因子的研究，就认为PPARγ和C/EBPα转录因子是调控成脂肪分化最重要的两个因子。转基因鼠和众多细胞系的研究成果，提示PPARγ和C/EBPα在成骨成脂肪分化方向调控中发挥重要作用，尤其是PPARγ被认为是其中的关键因子。但是目前的一些研究就提示慎重考虑种属问题，并且转基因鼠和细胞系得到的结果也有相互矛盾之处。目前关于PPARγ在人成骨成脂肪中的作用的数据大多来自噻唑烷二酮类（TZD）降糖药。各类TZD药物对成骨成脂肪的作用不一。目前关于PPARγ和C/EBPα在人MSC分化成骨成脂肪中的作用目前研究的尚少，得到的结果也有相互矛盾之处。　　 有鉴于此，本研究的主要内容如下：　　 第一部分：体外分离培养扩增MSC，并建立成骨成脂肪诱导分化体系。　　 第二部分：探讨PPARγ在成骨成脂肪中的表达规律，并进一步通过慢病毒介导的RNA干扰来研究PPARγ在成骨成脂肪中的作用。　　 第三部分：探讨C/EBPα在成脂肪中的表达规律，并进一步通过慢病毒介导的RNA干扰来研究C/EBPα在成脂肪中的作用。　　 第一部分成人骨髓间质干细胞体外分离、培养、扩增及成骨成脂定向诱导分化体系的建立　　 1、方法　　 取成人骨髓，Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离得到单个核细胞，用含10％FBS的L-DMEM培养液重悬，贴壁培养，三天后通过换液去除未贴壁细胞。以后每隔三天换液继续培养贴壁细胞。细胞接近融合之后，用0.25％的胰酶消化按照1:3的比例传代。对体外培养的MSCs进行形态学的观察，并通过定向诱导MSCs分化为成骨细胞和脂肪细胞来确认其多向分化潜能。　　 成脂诱导分化：单层培养的MSC长满之后四天，加入含地塞米松、IBMX、牛胰岛素、indomethacin和10％FCS的H-DMEM（脂肪诱导液）诱导3天，再用含牛胰岛素和10％FCS的H-DMEM（脂肪保持液）处理1天，如此循环3次后，用脂肪保持液处理7天，每隔3-4天换液1次。用油红O染色的方法来鉴定胞内的脂滴，用半定量RT-PCR的方法来鉴定一些脂肪相关基因（包括LPL、αP2和PPARγ2）的表达。　　 成骨诱导分化：单层培养的MSCs以5×103/c㎡的密度接种，培养至细胞密度达到约60％～70％长满，加入含β-甘油磷酸钠、维生素C、地塞米松和10％FCS的L-DMEM（成骨诱导液）开始诱导，每3天换液一次，如此循环。诱导一周后用半定量RT-PCR的方法检测成骨相关基因bone sialoprotein（BSP）、collagen typeⅠ（COLⅠ）和osteocalcin（OCN）的表达情况。诱导15天后用茜素红染色的方法来鉴定钙结节。　　 2、结果　　 原代MSCs在贴壁后第12～15天左右可达80％～100％的融合度。其后用胰酶消化传代，随着传代次数的增多，杂细胞得以迅速清除。MSC在体外有强大的增殖能力，在第5代可获得约9×107个MSC，而到了第10代，则可获得4-5×109个MSC。早期代数的细胞一般呈纺锤形的成纤维细胞的形态，随着传代次数增多形态逐渐变得扁平宽大。但是第4到第8代的细胞其成脂和成骨分化的能力没有明显区别。　　 在诱导的第四天就可以见到脂滴形成，但2～3个星期是MSC诱导分化为成熟脂肪细胞所需要的。MSC的成脂分化过程从形态的演变方面很好地模仿了体内脂肪细胞的分化过程。MSC分化而来的脂肪细胞表达LPL、FABP4和PPARγ2等脂肪特异基因。　　 在成骨诱导的第7天，显微镜下可以见到微小的钙结节形成，诱导2～3星期后钙结节才能充分形成。MSCs分化而来的成骨细胞表达BSP、OCN、COLⅠ等成骨相关的基因。　　 3、结论　　 MSC可以用淋巴细胞分离的方法从骨髓分离得到。MSC具有强大的增殖能力，可在体外大量扩增。随着传代次数的增加和培养时间的延长，细胞变得宽大，但是仍保持良好的多向分化潜能。MSC分化得到的脂肪细胞和成骨细胞在形态和相关基因的表达上与体内的脂肪细胞和成骨细胞类似，因此MSC是一个良好的研究成骨成脂肪分化的模型。　　 第二部分转录因子PPARγ在成人骨髓间质干细胞　　 诱导分化成骨成脂肪中的作用　　 1、方法　　 MSC按4×103/c㎡密度接种于6孔板，细胞达到完全融合四天后，加入胰岛素、IBMX、indomethacin、地塞米松等诱导剂，分别在0、1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、16天收集裂解细胞，western blot方法检测PPART两种亚型的表达变化情况。　　 通过加入不同组合的成脂肪诱导剂，以进一步了解PPARγ两种亚型表达的机制，以及PPARγ1和PPARγ2两种亚型在MSC诱导分化成脂肪中的作用。　　 Troglitazone和BADGE用以替代indomethacin，以进一步研究配体对PPARγ表达的作用。　　 类似的，MSC按4×103/c㎡密度接种于6孔板，细胞达到60～70％融合后，加入成骨细胞诱导液（OS）（含10-7mol/L地塞米松，10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠，50μg/mL vitamin C），分别在0、2、4、6、8、10、12、14天收集裂解细胞，western blot方法检测PPARγ的表达变化情况。　　 利用基于慢病毒载体PLL3.7的shRNA干扰技术，进一步探讨PPARγ在MSC诱导分化成骨成脂肪中的作用。对病毒转染后的细胞进行成骨成脂肪诱导分化。通过定量PCR和western blot检测判断PPARγ干扰的有效性。通过油红O染色和定量的方法，判断PPARγ干扰对MSC诱导分化成脂肪中脂肪滴形成的影响；并通过定量PCR检测成脂肪相关基因LPL、FABP4和GPDH，以进一步判断PPARγ干扰对MSC成脂肪诱导分化的影响。通过碱性磷酸酶染色和活性测定，判断PPARγ干扰对MSC分化成骨早期的影响；通过茜素红S染色和钙定量，判断PPARγ干扰对MSC分化成骨终末期钙沉积的影响。　　 2、结果　　 PPARγ两种亚型在未分化的MSC中并不表达，在加入成脂肪诱导剂之后第二天，就检测到PPARγ1的表达，但是PPARγ2的表达则在脂肪诱导的第六天才检测到。加入脂肪诱导维持液以后，PPARγ的表达不但没有继续增加，反而有所下降。PPARγ的表达在脂肪诱导的第三个循环（第9-11天）达到最高，在脂肪诱导的最后维持阶段PPARγ的表达下降。在整个脂肪诱导分化过程中，PPARγ1都是为主要表达方式。　　 通过油红O染色和定量，我们发现，不加Dex的各组几乎没有成脂肪的，而且细胞形态也还是保持梭形。而单独加入Dex，就可以引起MSC分化成脂肪中的细胞形态改变，细胞形态从梭形变为圆形，但是单独Dex处理，并没有明显的脂肪滴形成。在加有Dex的基础上，加indomethacin或和IBMX都能引起一定程度的脂肪滴形成，加indomethacin的脂肪滴形成更多，加有indomethacin和IBMX能得到最高的诱导效率。但是进一步添加insulin，我们发现并不能提高诱导率。　　 Western blot检测的结果发现，单一诱导剂（包括Dex）都无法导致PPARγ的表达。加有Dex的基础上，我们发现再加入insulin不能导致PPARγ的表达。加入indomethacin或IBMX之后能导致PPARγ1的低表达，但未能检测到PPARγ2的表达。值得注意的是，indomethacin比IBMX导致的PPARγ1的表达高。在同时加入indomethacin和IBMX的情况下，PPARγ1的表达明显增高，并开始有PPARγ2的表达。在此基础上进一步添加insulin对PPARγ1和PPARγ2的表达没有明显的影响。　　 在去除indomethacin的实验条件下，再添加Troglitazone或BADGE，能很明显的诱导分化成脂肪，但是与加入indomethacin组相比，诱导分化的效率要差一些。Western blot检测就发现，加入Troglitazone或BADGE不但促进PPARγ1的表达，而且能促进PPARγ2的表达。　　 在MSC成骨诱导分化两天后，开始检测到PPARγ1的表达，在MSC诱导分化成骨中PPARγ1的表达逐渐增强，在诱导分化的最后阶段达到最高峰。但是与MSC诱导分化成脂肪相比，在整个MSC诱导分化成骨中PPARγ1的表达都较低，而且在整个MSC诱导分化成骨中PPARγ2的表达始终没有检测到。　　 在MSC诱导分化成骨中，单纯地塞米松就能诱导PPARγ1的表达，并且维生素C和β-甘油磷酸钠能进一步促进PPARγ1的表达。　　 基于慢病毒载体PLL3.7，成功构建了PPARγshRNA干扰载体，并通过定量PCR和western blot验证了干扰序列的有效性。按照MOI=10的条件，成功的将病毒转导入MSC中。对转导病毒之后的MSC进行成脂肪成骨诱导。油红O染色和定量的结果显示了脂肪滴形成受到明显抑制；定量PCR检测的结果，也显示LPL、FABP4和GPDH等脂肪相关基因的表达受到抑制；通过western blot检测，发现PPARγ干扰同时导致C/EBPα的表达下降。在成脂肪诱导条件下，PPARγ干扰导致碱性磷酸酶活性轻微下降，未能检测到钙形成的变化。在成骨诱导条件下，PPARγ干扰导致碱性磷酸酶活性轻微下降，同时发现钙沉积受到一定的影响。同时诱导分化成骨成脂肪的条件下，观察到类似的现象。　　 3、结论　　 3.1 PPARγ1和PPARγ2两种亚型在MSC分化成脂肪中都有表达，但以PPARγ1的表达为主。PPARγ1可能在MSC分化早期中起到重要作用，而PPARγ2是MSC诱导分化成熟的关键转录因子。　　 3.2 Insulin对MSC诱导分化成脂肪没有明显作用，这可能是骨髓中脂肪细胞的特性，提示了利用骨髓间质干细胞研究骨髓中细胞分化的必要性。　　 3.3 PPARγ2的表达需要indomethacin等配体的存在，但是BADGE的结果提示可能有种属差异的存在。　　 3.4 PPARγ1在MSC诱导分化成骨中表达，Dex在其中可能发挥重要作用，但具体机制不明确。　　 3.5 PPARγ干扰之后，MSC诱导分化成脂肪受到明显抑制，但并没有明显促进MSC诱导分化成骨，反而对MSC诱导分化成骨有轻微的促进作用，提示在人MSC诱导分化方向的调控中，PPARγ可能不是一个关键的因素。　　 第三部分转录因子C/EBPα在成人骨髓间质干细胞　　 诱导分化成脂肪中的作用　　 1、方法　　 MSC按4×103/c㎡密度接种于6孔板，细胞达到完全融合四天后，加入胰岛素、IBMX、消炎痛、地塞米松等诱导剂，分别在0、1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、16天收集裂解细胞，western blot方法检测C/EBPα表达变化情况。　　 通过加入不同组合的成脂肪诱导剂，以进一步了解C/EBPα表达的机制，以及C/EBPα在MSC诱导分化成脂肪中的作用。　　 利用基于慢病毒载体PLL3.7的shRNA干扰技术，进一步探讨C/EBPα在MSC诱导分化成脂肪中的作用。对病毒转染后的细胞进行成脂肪诱导分化。通过定量PCR和western blot检测C/EBPα干扰序列的有效性。通过油红O染色和定量的方法，判断C/EBPα干扰对MSC诱导分化成脂肪中脂肪滴形成的影响；并通过定量PCR检测成脂肪相关基因LPL、FABP4和GPDH，以进一步判断C/EBPα干扰对MSC成脂肪诱导分化的影响。　　 2、结果　　 C/EBPα在未分化的.MSC中并不表达，在加入成脂肪诱导剂之后第三天，才检测到C/EBPα的表达，而且，我们发现在加入脂肪诱导维持液以后，C/EBPα的表达不但没有继续增加，反而下降。C/EBPα的表达在脂肪诱导的第三个循环（第9-11天）达到最高，在脂肪诱导的最后维持阶段C/EBPα的表达下降。　　 单一诱导剂都无法导致C/EBPα的表达。加有Dex的基础上，我们发现再加入I nsulin仍不能导致C/EBPα的表达。加有Dex的基础上，加入indomethacin能明显导致C/EBPα的表达，尽管表达程度不高，但加入IBMX，并不能导致C/EBPα的明显表达。只有同时加入indomethacin和IBMX的情况下，C/EBPα才能充分表达。但在此基础上进一步添加insulin对C/EBPα的表达没有很大的影响。　　 成功构建了基于慢病毒的C/EBPαshRNA干扰，并通过定量PCR和westernblot验证了干扰序列的有效性。按照MOI=10的条件，成功的将病毒转导入MSC中。对转导病毒之后的MSC进行成脂肪诱导。油红O染色和定量的结果显示了脂肪滴形成受到明显抑制；定量PCR检测的结果，也显示LPL、FABP4和GPDH等脂肪相关基因的表达受到抑制；通过western blot检测，发现C/EBPα干扰同时导致PPARγ2的表达下降，但是对PPARγ1的表达没有太大的影响。　　 3、结论　　 3.1 C/EBPα在MSC诱导分化的早期开始表达，但是在MSC诱导分化的晚期下降，提示C/EBPα可能在MSC分化的早期发挥作用。　　 3.2 Insulin对C/EBPα的表达没有明显作用，这进一步提示骨髓中脂肪细胞的特殊性。　　 3.3 C/EBPα的表达时间较PPARγ1晚，但是早于PPARγ2的表达。各诱导剂作用的结果也表明，只有PPARγ1表达的情况下，C/EBPα才表达。RNA干扰C/EBPα，对PPARγ1的表达没有明显影响，但是明显抑制PPARγ2的表达。而RNA干扰PPARγ，则明显抑制C/EBPα的表达。这些结果，都提示了PPARγ1-C/EBPα-PPARγ2的表达时间顺序。　　 3.4 C/EBPα干扰后，MSC诱导分化成脂肪受到明显抑制，这提示C/EBPα可能在MSC分化的早期就发挥重要。