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阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种神经退行性疾病,以神经纤维缠结(neurofibrillary tangle, NFT)和老年斑(senile plaque, SP)为主要病理特征,其中神经纤维缠结的本质是过度磷酸化的tau堆积。AD的病因和发病机制迄今尚不清楚,临床上也缺乏有效药物,因此有关发病机制以及新的药物作用靶点的探索,一直是研究的热点。瘦素(Leptin)是一种中枢性能量代谢调节因子，在炎症反应和创伤修复方面也具有重要功能,有关其神经保护作用的研究也引起广泛关注。为了解leptin在拟AD样损伤中的作用及其分子机制,本研究拟用冈田酸（okadaicacid, OA）作为诱导剂建立神经母细胞瘤细胞系（SH-SY5Y）AD模型、原代海马神经元AD模型及器官型脑片AD模型,探讨leptin对拟AD样损伤的调节及其作用机制,并在AD患者尸检脑组织切片中观察病理改变。本研究包括下述4个部分：第一部分Leptin通过抑制Cdk5(细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶5)在神经母细胞瘤细胞系tau过度磷酸化中发挥的保护作用；第二部分Leptin在原代海马神经元tau过度磷酸化中的神经保护作用及可能的分子机制；第三部分Leptin在器官型脑片拟AD样模型中发挥的神经保护作用；第四部分AD患者尸检脑组织海马区病理观察及检测。结果如下：1在SH-SY5Y细胞系水平上建立拟AD样细胞模型（1） OA作为诱导剂处理细胞,可成功建立tau蛋白过度磷酸化的拟AD样细胞模型；400ng/mL leptin处理细胞6h显著增加细胞活力，说明leptin对细胞有保护作用；（2）免疫荧光双染法显示，ObR与Cdk5、ObR与p-tau均存在共表达,提示ObR与二者之间均有可能存在相互作用；（3） leptin能够剂量依赖性地降低p-tau蛋白水平，并显著下调Cdk5（导致tau蛋白过度磷酸化的直接因素）表达, ObR特异性封闭剂则可以逆转上述作用，说明leptin与其受体结合通过抑制Cdk5表达来降低p-tau水平；（4）SiRNA沉默Cdk5表达可降低p-tau,而Cdk5的化学抑制剂Roscovitine则不能达到这一效果。2在原代海马神经元水平上建立拟AD样细胞模型（1）AD主要病变区域集中在海马组织，该部分使用原代海马神经元旨在表现leptin对病变位置细胞的保护作用。模型建立后, ObRb mRNA表达显著升高,提示AD模型中leptin可能通过其长型受体发挥效应；（2）与细胞系水平一致,在原代神经元中leptin显著降低Cdk5及p-tau表达, ObR特异性封闭剂则可以逆转上述作用；SiRNA使Cdk5沉默可降低p-tau,而Cdk5化学抑制剂Roscovitine则不能；（3） OA诱导模型后ERK1/2（细胞外调节蛋白激酶1/2）过度激活,而leptin可以下调其活化；利用ERK的特异性抑制剂U0126,则可以下调Cdk5及p-tau；说明ERK1/2在leptin对拟AD样损伤的保护作用中发挥了重要作用；（4） Cdk5的抑制剂Roscovitine上调ERK1/2的活化,在3h-6h期间达到顶峰,6h以后至12h开始降低，这可以解释其为何不能降低p-tau水平。3在器官型脑片水平上建立拟AD样组织模型（1）器官型脑片属组织水平，能够更好的模拟组织中细胞间的相互影响，更贴近体内环境。Real-time PCR显示, OA诱导后, ObRb mRNA表达显著升高；（2）与细胞水平一致, leptin显著降低p-tau及Cdk5表达, ObR特异性封闭剂则可以逆转上述作用；Cdk5SiRNA处理可降低p-tau,而Cdk5抑制剂Roscovitine则不能。4AD患者尸检脑组织病理改变（1）尸检组织病理切片能够很直观地观察到AD患者海马组织的病变情况，结果最为真实。HE染色显示,细胞排列紊乱,可见大量细胞变性、坏死,胞浆疏松,有明显空泡样颗粒变性,空泡内细胞体积明显缩小；（2）免疫荧光双染法显示,病变区域ObR与Cdk5、ObR与p-tau存在共定位且荧光强度均较高,而正常区域则均较低；（3）免疫组化结果显示, ObR在病变区域中分布较广泛,而正常组织则较少。Cdk5、p-tau蛋白阳性细胞多分布于空泡状结构,正常组织中分布较少。综上所述,本研究表明：（1）外源性leptin能够通过与其长型受体ObRb结合,在拟AD样tau过度磷酸化损伤中发挥神经保护作用；（2） Leptin在OA诱导的AD模型中,显著降低Cdk5表达,降低tau过度磷酸化水平；（3） AD发生过程中, ERK1/2过度激活,外源性leptin可以下调其活化；（4）抑制ERK1/2可以起到下调Cdk5及p-tau水平的作用；（5） SiRNA直接干扰Cdk5基因可以起到下调p-tau的作用,而其化学抑制剂由于会激活ERK1/2不能达到这一效果。（6） AD患者尸检脑组织病理切片中可见,由于内源性leptin含量较低,ObR、Cdk5、p-tau在病变区域表达增加,后两者导致显著病理改变。