电致化学发光（ECL）免疫分析技术,结合了ECL分析技术的高灵敏度和高可控性与免疫识别的高特异性,能显著提高生物蛋白分子检测的灵敏度和选择性,在免疫生物学和临床检验学等研究中展现出巨大的应用潜力。向ECL体系中引入共反应剂可显著增强其ECL强度,有效提高免疫传感器灵敏度。然而,一些共反应试剂存在不稳定、难标记的缺点,增加了操作难度和测量误差。并且,传统的基于发光试剂和共反应试剂分子间相互作用的ECL类型电子传递距离长、能量损失大、稳定性欠佳。基于此,本论文主要从提高共反应试剂的作用效率出发,通过酶催化原位产生共反应试剂及合成新型自增强型ECL试剂,并结合多种纳米复合物的辅助,构建多个ECL免疫传感器,实现多种疾病相关蛋白质的灵敏检测。本论文的研究工作主要分为以下几部分:1.基于双酶催化原位产生共反应试剂的电致化学发光免疫传感器的研究由于某些共反应试剂不稳定、难于标记的缺点使得一些ECL体系的应用受到了很大的限制。本研究利用酶催化反应在电极表面原位产生共反应试剂很好地解决这一问题。研究表明,葡萄糖氧化酶及辣根过氧化物酶可以协同催化底物葡萄糖水解并产生O₂。因此,本工作中我们提出一种双酶协同催化原位产生O₂的策略,并成功将其应用于S₂O₈^2--O₂ ECL体系,实现了信号的放大及稳定性的提高。基于该双酶催化放大策略并结合L-半胱氨酸及金纳米颗粒对ECL反应的促进作用,构建了一个简单、免标记,且具有高灵敏度及高选择性的ECL免疫传感器,并将其应用于甲胎蛋白（AFP）的检测。该工作为基于S₂O₈^2--O₂ ECL体系的传感器的构建提出了一种新型的信号放大方法,并拓宽了其应用。2.基于富勒烯功能化的钯纳米笼及仿双酶原位产生共反应试剂的电致化学发光免疫传感器的研究本研究中利用纳米材料作为仿酶很好地克服生物酶易失活、反应条件苛刻等缺点,拓宽了酶催化反应的应用范围。以银纳米立方为模板,通过置换反应制得内部空虚外部多孔的钯纳米笼结构（Pd NCs）,并修饰上L-半胱氨酸（L-Cys）功能化的富勒烯(C₆₀)得到C₆₀-L-Cys-Pd NCs复合纳米材料。由于其良好的电催化活性及大的比表面积,C₆₀-L-Cys-Pd NCs可以很好地应用于生物传感器的构建。本工作中我们利用C₆₀-L-Cys-Pd NCs固载葡萄糖氧化酶、二抗蛋白,构建了检测猪链球菌（SS2）的夹心型电致化学发光免疫传感器。C₆₀-L-Cys作为S₂O₈^2--O₂ ECL体系的新型的共反应试剂极大地增强了ECL强度。并且,在底物葡萄糖存在的情况下,葡萄糖氧化酶与Pd NCs构成仿双酶体系:葡萄糖氧化酶催化底物葡萄糖生成过氧化氢（H2O₂）,而Pd NCs作为辣根过氧化物酶的模拟酶进一步催化H2O₂分解产生O₂,进而显著增强了S₂O₈^2--O₂体系的ECL信号。该传感器的线性范围为0.1 pg mL^-1100 ng mL^-1,检出限为33.3 fg mL^-1。3.基于绿色方法合成钯纳米线的自增强型电致化学发光免疫传感器的研究传统的ECL反应中,发光试剂与共反应试剂均是通过分子间的相互作用实现的。然而,这种分子间的作用通常伴有较大的能量损失,限制了发光强度的提高。鉴于此,本研究将发光试剂羧基化联吡啶钌（Ru）与共反应试剂聚酰胺-胺（PAMAM）树状分子交联形成新型自增强型ECL衍生物（PAMAM-Ru）。该ECL衍生物通过发光基团与共反应基团分子内的相互作用及能量传递,缩短了作用距离、减少了能量损失,极大地提高了发光效率及稳定性。以绿色合成的、且具有较大比表面积及电催化性质的线状钯纳米材料为支撑固载该ECL衍生物并标记二抗蛋白,构建信号增强型的ECL免疫传感器,成功实现了对癌胚抗原（CEA）的灵敏检测。该方法所合成的新型自增强型的ECL衍生物具有更高的发光效率及稳定性,为ECL技术更好地应用于临床分析提供了可能。4.基于生长在钯纳米笼上的聚合链构建自增强型电致化学发光免疫传感器的研究在自增强型ECL衍生物的合成中,我们通过聚合反应极大地增加了发光基团的含量,进一步显著提高了发光效率。即以内部空虚外部多孔的钯纳米笼结构（Pd NCs）为支撑固载大量的共反应试剂聚乙烯亚胺（PEI）,并通过原子自由基聚合反应在PEI上原位生长含发光基团Ru（II）配合物的聚合链,得到自增强型ECL复合物（Pd NCs-PEI-PSRu）。该复合物通过发光基团与共反应基团分子内的相互作用,缩短了反应距离、减少了能量损失,提高了发光效率及稳定性。并且,通过原子自由基聚合反应提高了该复合物中发光基团Ru（II）配合物的固载量,更有效地增加了ECL强度。以所制得的复合物标记二抗并作为信号探针,并用金纳米颗粒功能化的石墨烯作为基底,构建了夹心型的、用于检测糖类抗原15-3（CA15-3）的ECL免疫传感器。其线性范围为0.01 U mL^-1120 U mL^-1,检测限为0.003 U mL^-1。5.以自增强型钌（II）配合物纳米棒作为电致化学发光材料构建免疫传感器的研究本研究首次直接以所合成的自增强型钌（II）配合物发光试剂为前体,通过溶剂蒸发诱导的自成核作用合成了具有极高发光效率的棒状纳米材料。该发光材料的合成简便、有效,且具有以下优点:首先,自增强型钌（II）配合物前体通过发光基团与共反应基团的分子内电子及能量传递,具有很高的发光效率;其次,经自成核形成棒状纳米材料后,该钌（II）配合物的固载量明显增加,发光效率进一步提高;另外,由于该纳米棒带正电荷并含氨基基团,使得该材料易于功能化。为增强其导电性,研究中将带负电性的铂纳米粒子吸附在其表面并标记二抗作为信号探针,通过夹心免疫反应构建信号增强型免疫传感器,实现了对糖尿病肾病标志物N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）的灵敏检测。该兼具高效固载与高发光效率的新型ECL发光纳米材料的合成为新型超灵敏ECL临床检测新体系的建立提供了新思路和新平台。