1.目的本课题是国家自然科学基金项目-—《中药药动学中的微透析与稳定同位素标记联用技术研究》(编号：30772791)中的一部分。微透析技术是一种新兴的体内药物分析技术,利用该技术可实现局部组织细胞外游离态药物浓度的连续和动态监测。但是,目前在微透析技术的应用中,常存在回收率可变性大的问题,回收率的准确性限制了此项技术的应用。本基金在前期研究中,引入了稳定性同位素作为待测物的内标物,初步建立起了基于稳定同位素为内标的微透析技术,并将其称之为“稳定同位素内标微透析技术”。该技术已成功地解决了取样过程中回收率可变性大的问题。本课题在已有的研究基础上,以尼古丁(nicotine)成瘾大鼠为受试对象,nicotine经皮制剂给药后,利用所建立的稳定同位素内标微透析技术,进行血液及脑局部药动学研究及脑局部的PK-PD模型研究,从而探讨药物在体内的吸收、分布、代谢过程及作用机理。通过一系列的应用研究进一步地证明稳定同位素内标微透析技术的科学性、可行性,并为今后新型给药系统的研究建立一整套更为准确、可信的药物动力学及药效动力学分析方法。2.方法本课题的研究方法分为以下几个方面：2.1稳定同位素内标微透析技术方法的建立本部分的研究在基金组成员建立的基础上进行了方法学上的考察及验证。利用LC-MS/MS技术对nicotine与DL-nicotine的检测方法进行了考察。考察项目包括液相条件与质谱条件,旨在建立一种能同时检测nicotine和DL-nicotine的检测方法。在以上基础上进行了nicotine体外回收率与DL-nicotine体外释放率的比——P值的变化特性的考察。其中的考察内容包括：灌流的流速对P值的影响、内标灌流液的浓度对P值的影响、大鼠体内取样时验证灌流液浓度的P值影响。2.2 nicotine成瘾动物模型的研究本部分研究以健康雄性SD大鼠为受试动物,建立大鼠的nicotine成瘾模型。将受试动物分组为nicotine组、催瘾组、预防给药组和生理盐水对照组,各组长时期反复皮下注射nicotine,试验前期剂量逐步递增、后期维持一定的安全剂量;末次给药后,各组均撤药,其中对撤药催瘾组进行腹腔注射纳络酮予以激发,观察各组撤药后20min内大鼠的成瘾行为和症状的变化,并按照拟定的评分表对大鼠成瘾行为进行评分,各组的评分值进行独立样本的t检验。2.3血液与脑局部药动学的初步研究本部分研究以nicotine成瘾大鼠模型为受试动物,大鼠采样前进行脱毛预处理,采样时探针植入大鼠右侧颈静脉与脑部右侧纹状体,并以内标DL-nicotine灌流平衡,nicotine以腹部经皮方式给药,给药后取样,分别收集上述两部位的透析液样品；样品采用LC-MS/MS法检测,数据采用药动学软件DAS2.0进行分析。2.4清醒自由活动状态下的大鼠的脑局部药动学研究本部分的研究以nicotine成瘾大鼠模型为研究对象。大鼠在微透析取样前预先埋置探针专用套管,并脱毛处理给药部位的皮肤。取样当天将探针顺着套管植入脑组织,并将大鼠放入清醒微透析取样装置中,连接好各管路,以内标DL-nicotine灌流平衡,nicotine腹部经皮制剂给药后开始采样,样品采用LC-MS/MS法检测,数据采用药动学软件DAS2.0进行分析。2.5 Nicotine经皮制剂的PK-PD结合模型的研究研究前期经大量相关nicotine成瘾机制的文献查阅,从中筛选出了几种有代表性的效应指标——单胺类神经递质NE、DA、5-H,并用LC-MS/MS技术建立一种能同时检测出药效指标NE、DA、5-H、nicotine和DL-nicotine五种成分的检测方法。微透析取样前对给药部位脱毛处理,取样试验时先麻醉动物再将探针植入大鼠脑部右侧纹状体,内标灌流平衡,nicotine以腹部经皮方式给药,给药后采样,样品采用LC-MS/MS法检测,用WINOLINE进行PK-PD相结合模型拟合。2.6分别用四种不同的灌流液——空白人工脑脊液溶液、水、DL-nicotine的水溶液和DL-nicotine的人工脑脊液对单胺类的混合溶液进行灌流平衡,取透析液计算出每种灌流下的渗透压与单胺类的回收率。3.结果3.1建立了nicotine与DL-nicotine的含量测定方法—LC-MS/MS法。液相色谱条件色谱柱：Hypersil Gold C18柱(150×2.1mm,3μm, Thermo, USA);流动相：甲醇-2mmol/L乙酸铵(70：30)；流速：0.21mL/min;进样量：5μL。质谱条件离子源为大气压电喷雾离子源(ESI)；喷雾电压：3.0kV；鞘气压力：25psi；辅助气流量：5 arbitrary units;金属离子传输毛细管温度：300℃；碰撞能量：25eV；正离子检测；扫描方式：选择离子反应监测(SRM),用于定量分析的离子对为m/z 163/130 (nicotine), m/z 166/130 (DL-nicotine)。nicotine与DL-nicotine峰形良好,杂质无干扰,出峰时间约2.7min。nicotine在2.067ng/ml～20.67μg/ml范围内线性关系良好,DL-nicotine在22.47ng/ml～22.47μg/ml内线性关系良好。日内精密度为准确度与精度密均良好,均能达到检测要求。体外模拟试验时,灌流速度改变,P值不改变,P=0.99±0.03；内标灌流速度改变,P值不改变,P=1.01±0.04。体内校正试验时,以不同浓度的nicotine和DL-nicotine的混合灌流液灌流,各浓度组的P值不变,P=1.00±0.01。3.2大鼠撤药后,除了生理盐水对照组,各组出现不同程度的下列戒断症状：咀嚼/错齿、扭体/喘气、颤抖/震颤、眼睑下垂、打哈欠及梳理皮毛等。而这些症状可以被nicotine经皮制剂明显减轻。各组评分值进行t检验,结果显示：组间评分有差别(P<0.01),具有统计学意义。3.3大鼠血液和脑部nicotine的配置过程均符合二房室模型：其中血液的t1/2α为29.38min,t1/2β为208.51min, AUC,(0-x)为152127.10 ug/L*min;脑部的t1/2α为86.64min, t1/2β为386.00 min, AUC(0-x)为152820.90 ug/L*min;两者的Tmax均为140min。试验结束时,两部位的样品均可检测出nicotine。3.4经皮给予nicotine后,清醒状态下的大鼠脑部的吸收和分布过程符合二房室模型,其中t1/2α为147.74min, t1/2β为203.78 min, AUC(0-x);为170235.1ng·L-1·min-1。试验结束时,脑部样品仍可检测出nicotine。3.5建立了nicotine、DL-nicotine及三种单胺类神经递质DA、NE、5-H的含量测定方法—LC-MS/MS法。液相色谱条件色谱柱：Hypersil Gold C18柱(150×2.1mm,3μm, Thermo, USA);流动相：水相(2mmol.L-1醋酸铵,0.01%甲酸j：有机相(甲醇)=15：85；流速：0.21mL/min;进样量：1OμL;样品盘温度：10℃。质谱条件离子源为大气压电喷雾离子源(ESI)；喷雾电压：3.0kV；鞘气压力：35psi；辅助气流量：5 arbitrary units;金属离子传输毛细管温度：350℃；碰撞能量：25eV；正离子检测；扫描方式：选择离子反应监测(SRM),用于定量分析的离子对为m/z 154/137(DA)、m/z 170/152 (NE)、m/z177/160 (5-H)、m/z 163/130 (nicotine), m/z 166/130 (DL-nicotine)。PK-PD相结合的样品经检测后,数据通过winolin软件进行处理,得到了DA、NE、5-H的浓度与nicotine的浓度的关系的方程式。3.6不同渗透压下的单胺类的回收率不一致,灌流液的渗透压可以影响物质的回收率。渗透压越大,物质的回收率越小。4.结论4.1建立了可以实现同时测定微透析样品中nicotine及其内标物DL-nicotine浓度的LC-MS/MS法,为稳定同位素内标微透析技术的实现奠定了分析基础。从体外和体内两方面对稳定同位素内标微透析技术应用于药物动力学研究的可靠性进行了比较全面的考察,经证实,以DL-nicotine为nicotine的微透析内标物切实、可行。4.2模型组大鼠均产生依赖性,且连续多次给药的过程中少有个体发生中毒死亡情况。反复少剂量皮下注射的方式减少了因一次大量给予nicotine所致试验动物急性中毒死亡,比较符合生活中烟草的反复摄入的形式。此方法造模的短、依赖程度高死亡率低,因此切实可行。4.3两部位的药动学参数有所差异：有血液与在脑部的吸收总水平相关不大,但在血液中的分布与消除速度均比在脑部中的快(t1/2α脑<t1/2α血液、t1/2β脑< t1/2β血液),血液中的最大药物浓度要比脑部高。4.4清醒状态下的大鼠脑局部nicotine的吸收配置过程符合二房室模型,清醒状态下的脑部吸收比麻醉状态下的吸收水平高,最高药物浓度与曲线下面积均是清醒状态大于麻醉状态。4.5本试验建立了一种能同时测定出DA、NE、5-H、nicotine和DL-nicotine的检测方法,该方法具有较高的专属性,与杂质无干扰,各物质线性关系良好,定量下限、日内精密度与日内稳定性均达到生物样品的分析要求。因此,可用于稳定同位素内标微透析技术在nicotine经皮制剂的PK-PD相结合模型的研究。nicotine对大鼠脑部纹状体的单胺类的神经递质的表达有抑制作,药物浓度增加,抑制作用变得更加明显。4.6在使用内标法时,应当考虑内标加入灌流液而引起的回收率的变化,此进,要重新校正P值。