犬细小病毒（Canine parvovirus,CPV）感染犬主要表现为出血性肠炎,对幼犬的致死率高达70%,该病呈全球性流行。CPV极易发生变异,自20世纪70年代后期出现至今,已出现了多种抗原型流行毒株,包括CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c以及New CPV-2a、New CPV-2b等。对流行毒株的流行病学调查和病原特征研究有助于该病的防控,本研究的目的是调查成都市CPV的流行情况及病原生物学特征。主要研究结果如下:1.CPV的分布及其混合感染情况为了解成都市CPV的感染情况,采用CPV特异PCR方法,对2016-2018年采自成都市6家宠物医院176份幼犬腹泻粪便样本进行检测,并对CPV阳性样本中犬冠状病毒（Canine coronavirus,CCoV）、犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV）、犬轮状病毒（Canine rotavirus,CRV）、犬微小病毒（Minute virus of canines,MVC）、犬腺病毒2型（Canine Adenovirus type 2,CAV-2）、犬圆环病毒（CanineCircovirus,CanineCV）、犬星状病毒（Canine astrovirus,CaAstv）和犬库布病毒（Canine Kobuviruses,CaKoV）进行PCR检测。结果显示,CPV的阳性率为72.73%,其中仅有11.72%的CPV阳性样本为单一感染,88.28%的CPV阳性样本为2⁶种病毒混合感染,混合感染样本中其它病毒的阳性率分别为CCoV 50.78%、CDV 28.13%、CAV-2 3.13%、CRV 10.94%、MVC 8.59%、CanineCV 17.97%、CaAstv 40.63%和CaKoV 46.88%,2⁶重病毒混合感染率分别为20.31%、34.38%、19.53%、11.72%和2.34%。本研究结果表明,CPV是成都市幼犬腹泻的主要原因,且与多种病毒混合感染现象普遍,严重影响犬腹泻的诊疗效果。2.CPV的抗原型为了解成都市CPV流行毒株的抗原型,随机选取60份CPV阳性样本（每年20份）,PCR扩增其VP2基因片段,产物测序并进行序列分析,截取每个目的片段中的501 bp进行分析,根据其第297、426位关键位点的氨基酸替换情况进行分型。结果显示,New CPV-2a型为71.67%,New CPV-2b型为11.67%,CPV-2c型为16.67%,其中2016年New CPV-2a型、New CPV-2b型和CPV-2c型的阳性率分别为75%、25%和0%,2017年为85%、5%和10%,2018年则为55%、5%和40%。本研究结果表明2016-2018年成都市有3种抗原型CPV流行,其中New CPV-2a型为优势抗原型,但呈下降趋势,而CPV-2c型则从2017年出现后快速增长到2018年的40%,成为优势流行型之一,说明成都市CPV流行毒株抗原型复杂多样,其中CPV-2c型的出现及其与现有疫苗保护力的关系值得进一步的研究。3.成功分离鉴定出3种抗原型CPV为进一步了解不同抗原型流行毒株的生物学特性,分别将选择的6份CPV阳性样本（New CPV-2a、New CPV-2b和CPV-2c阳性样本各2份）接种F81细胞,传代培养观察至少3代,对出现病变的细胞继续传代培养,待出现稳定病变后对其进行PCR和间接免疫荧光鉴定,分离毒株经空斑纯化后测定TCID₅₀。结果显示,6个接毒样本盲传至第3代时,3种抗原型阳性样本接毒的细胞均有1个样本出现细胞病变（CPE）,连续传至第5代后,New CPV-2a型、New CPV-2b型和CPV-2c型CPE稳定出现在接毒后96 h、96 h和72 h,细胞出现圆缩、崩解脱落和典型的拉网状病变,培养物的PCR产物测序分型结果与接毒样本的抗原型相同,间接免疫荧光可见细胞特异性亮绿色荧光,证实成功分离出3种抗原型CPV,命名为SC-16/2017/China（New CPV-2a）、SC-13/2017/China（New CPV-2b）和SC-14/2017/China（CPV-2c）,其TCID₅₀分别为10^3.5/0.1 mL、10^3.5/0.1 mL和10^4.7/0.1 mL。本研究成功获得了New CPV-2a型、New CPV-2b型和CPV-2c型毒株各1株,为该病毒的基础研究和应用研究奠定了物质基础。4.CPV 3个抗原型分离株的基因组特征为进一步了解CPV不同抗原型流行毒株的基因组特征和遗传进化关系,以GenBank中CPV全基因序列为模板（基因组全长约5200 bp）,用Premier 5.0软件设计了6对引物分段扩增3个抗原型分离株的全基因序列,克隆测序用DNAStar进行拼接,用Megalign和MEGA 7.0等对获得的基因组进行同源性和遗传进化分析。结果显示,本研究成功获得了3个抗原型分离株包含部分UTR和两个完整编码框的基因序列,序列长度分别为4611 bp（New CPV-2a型）、4595bp（New CPV-2b型）和4619 bp（CPV-2c型）,GenBank登录号为MT165694（New CPV-2a/SC-16/2017/China）,MT165692（New CPV-2b/SC-13/2017/China）,MT165693（CPV-2c/SC-14/2017/China）。3个抗原型分离株间的核苷酸同源性为98.8%⁹9.8%,与GenBank中CPV基因组核苷酸同源性为98.5%⁹9.8%。推导的氨基酸序列显示,3个抗原型分离株仅在VP2蛋白的第267位氨基酸位点出现一个共同的位点突变。New CPV-2a型分离株在NS1蛋白的第572、624位,VP2蛋白的第324、440位氨基酸位点出现突变;New CPV-2b型分离株在NS1蛋白的第19、544、545、583位,VP1独特区域的第116位氨基酸位点出现突变;CPV-2c型分离株在NS1蛋白的第60、544、545、630位,VP2蛋白的第5、324、370位,VP1独特区域的第131位氨基酸位点出现突变。这些在NS1蛋白上的位点变化可能会影响病毒感染早期的基因表达,在VP1独特区域的位点变化可能会影响病毒的感染力,而在VP2蛋白上的位点变化是否会影响其抗原性以及影响宿主体内中和抗体的产生值得进一步研究。遗传进化分析表明,本研究的New CPV-2a型分离株与2个国内的New CPV-2a型毒株（BJL-1、21-Sichuan）单独聚为一支,且这些毒株均为2015年之后的毒株,与2015年之前的中国毒株以及国外的毒株有一定的遗传距离,说明国内的该型毒株近年来出现了独特的进化趋势;本研究的New CPV-2b型分离株与3个中国的New CPV-2b型毒株（HB-1、JL-6、LZ2）单独聚为一支,与国外的New CPV-2b型毒株有一定的遗传距离,说明该型毒株在中国具有与国外不同的进化趋势;本研究的CPV-2c型分离株与2个来自四川的CPV-2c型毒株（08-Sichuan、16-Sichuan）单独聚为一支,而与国内其它地区的该型毒株具有一定的遗传距离,说明CPV-2c型毒株在四川地区具有独特的进化趋势。本研究通过对不同抗原型分离株基因组的分析揭示了流行毒株的基因组结构特征,为进一步研究CPV的遗传进化规律提供了重要参考。5.CPV 3个抗原型分离株的抗原性本研究通过比较CPV 3个抗原型毒株的抗原性,为研制具有保护多种抗原型CPV的疫苗毒株选择提供参考。分别将分离毒株SC-16/2017、SC-13/2017和SC-14/2017的TCID₅₀调整为10^3.5/0.1 mL,经1.5‰甲醛灭活后制备201佐剂灭活疫苗,3种抗原型疫苗均采用腿部及颈部皮下分点注射免疫各组5只蛋鸡,1mL/只,之后每隔14 d进行二免及三免,2 mL/只。收集不同免疫时期鸡蛋,血凝抑制试验（HI）和抗体交叉中和试验测定卵黄抗体效价。结果显示,3个实验组均在首次免疫后7 d左右检测到抗体,三免后10 d卵黄抗体HI效价达到最高峰(SC-16/2017组为2¹⁴,SC-13/2017组为2¹⁴,SC-14/2017组为2¹³),三免后84 d HI效价仍维持在2¹⁰左右。3个抗原型卵黄抗体针对New CPV-2a型、New CPV-2b型和CPV-2c型病毒的中和效价显示,New CPV-2a型卵黄抗体中和效价分别为1:890、1:110和1:890;New CPV-2b型卵黄抗体中和效价分别为1:890、1:220和1:1780,CPV-2c型卵黄抗体中和效价分别为1:890、1:450和>1:2560。本研究结果表明3个抗原型分离株均具有较好的免疫原性,能够诱导机体产生稳定、高价的抗体。3种抗原型卵黄抗体除对同型毒株具有保护效价外,对另外2种不同抗原型毒株也具有交叉保护效价,其中CPV-2c型分离株诱导机体产生的抗体交叉保护效价高于两外两种,建议CPV-2c型毒株可作为研制具有保护多种抗原型CPV的疫苗候选毒株。