论文部分内容阅读
癌症是目前人类死亡率最高的疾病之一，由于癌细胞对放疗和化疗产生耐药性，以及容易转移等特性，使得癌症难以根治。在癌症的发生过程中，常伴有某些有利于癌细胞生长的蛋白过量表达。凋亡抑制蛋白Survivin便是常见分子之一，它在乳癌等大多数癌细胞中过表达，据报道该分子的过度表达与促进癌细胞分化及造成耐药性相关，因而被认为是抗肿瘤治疗的重要靶标之一。 由于Survivin分子包含2个不同的结构域:BIR和CC，目前对于二者的具体作用与功能，以及二者分别在针对Survivin表达抑制的突变体抗癌蛋白中发挥何种不同作用，是否在已知的凋亡作用以外，如对癌细胞周期和细胞自噬等方面有某种功效?目前尚无相关报道。为此，本课题依据Survivin的2个功能性结构域（BIR和CC），分别构建并制备单个结构域蛋白，除了研究这两种蛋白对Bcap-37细胞的促凋亡作用之外，主要就其对乳腺癌细胞Bcap-37的细胞周期及细胞自噬方面的影响进行深入的探究。 在细胞凋亡方面，结果发现BIR(T34A)结构域蛋白仍然具备Survivin(T34A/117A)的促凋亡功能，在90μg/ml的浓度下作用48h后，其对乳腺癌Bcap-37细胞的抑制率达到35.4％，稍低于Survivin(T34A/117A)组的43.9％。其次，通过凋亡检测发现，经90μg/ml的TAT-BIR(T34A)作用36h及60h后，细胞的凋亡率分别达到35.2％和56.8％，显示该蛋白促进Bcap-37细胞凋亡的效果明显。同时，比较TAT-BIR(T34A)和Survivin(T34A/117A)促乳腺癌Bcap-37细胞凋亡的结果，在90μg/ml下作用36h后，TAT-BIR(T34A)组凋亡率达到35.4％,而Survivin(T34/117A)组凋亡率达到56.5％，两者相差较大，都呈浓度和时间依赖性。最后，通过Rh123染色观察实验发现，TAT-BIR(T34A)组和Survivin(T34/117A)组都能引起线粒体膜电势发生变化。 在周期及自噬方面，首先通过吖啶橙染色发现，经TAT-CC(T117A)和Survivin(T34/117A)作用后的细胞，其胞内产生自噬溶酶体。同时，采用免疫荧光检测胞内的自噬标志蛋白LC3B的含量时，发现经TAT-CC(T117A)和Survivin(T34/117A)作用后的细胞，荧光增强，表明LC3B的表达量增加，即细胞发生自噬作用。其次，用流式检测细胞的周期变化，发现TAT-B IR(T34A)和Survivin(T34/117A)组的细胞，其G0/G1期比例分别下降了6.47％和4.27％，而G2/M期比例都上升了5％左右，表明该两种蛋白能使Bcap-37细胞阻滞在G2/M期。而经TAT-CC(T117A)处理后，其G0/G1期和G2/M期比例分别下降了14.6％和8.2％，而S期细胞比例增加了22.17％，这表明处于休止期的细胞减少，大量细胞进入DNA复制阶段，促进细胞的有丝分裂。最后，Western blot也显示，经TAT-CC(T117A)处理后的细胞，其自噬标志蛋白LC3B的表达量增加了2.35倍，进一步验证上述结论。 综上所述，survivin的两个结构域中，TAT-BIR(T34A)能抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，阻碍有丝分裂的进行;而TAT-CC(T117A)能促进细胞发生自噬，促进DNA的复制及有丝分裂进程，为获得以Survivin为靶标的重组蛋白抗癌药物奠定基础。