论文部分内容阅读
研究背景自身免疫性脑炎（autoimmune encephalitis,AE）是一种非感染性的由致病性自身抗体所导致的免疫性炎症。以癫痫发作、精神行为改变、认知功能障碍、运动异常、意识障碍及自主神经功能障碍等为主要临床表现,颅脑MRI、脑电图及脑脊液常规检测无特异性表现。根据靶抗原在细胞的定位,AE分为神经元细胞表面抗原相关抗体介导的AE及神经元细胞内抗原相关抗体介导的AE。有研究报道肿瘤、感染及遗传因素可能参与了疾病的发生。NMDA受体是在中枢神经系统广泛表达的一类配体门控离子通道,属于离子型谷氨酸受体,多数是一个四聚体,它是由两个NR1和两个NR2亚单位构成,有多种配体结合位点且在脑内的分布不均,不同的分区和不同的结合位点与不同脑功能有关。NMDA受体主要功能是参与神经系统的兴奋性传递、突触重塑等多种重要生理功能,其功能异常可使受体失去对兴奋状态的抑制,导致神经-精神疾病的发生。抗NMDAR（anti-N-mythyl-D-aspartete receptor,NMDAR）)脑炎是神经元细胞表面抗原相关抗体介导的AE,是最早被发现和认识的AE,也是儿童最常见的自身免疫性脑炎。儿童抗NMDAR临床表现较成人略有不同,癫痫发作、精神症状、运动异常及语言减少较常见,而成人则以行为异常、记忆力障碍等多见。儿童抗NMDAR脑炎合并肿瘤少见,对糖皮质激素、静脉注射免疫球蛋白等免疫治疗具有良好的效果,预后良好,但有一定的复发率及致死率,对家庭和社会造成沉重的经济负担。抗NMDA受体的抗体对疾病的诊断和治疗非常重要,不仅是抗NMDAR脑炎诊断性标志物,而且体外实验及动物模型均证实抗NMDA受体抗体具有直接致病性,且脑脊液抗体滴度是和病情严重程度相关的,但目前关于抗原抗体结合是如何影响抗NMDAR脑炎的发生发展的研究很少。有研究通过单分子显微镜技术观察到,抗NMDAR脑炎发病机制可能与抗NMDAR抗体与NMDAR的NR1亚基结合,从而破坏其相邻EphB2受体稳定NMDR受体的作用,引起NMDA受体的内化进而影响突触功能。然而抗NMDAR脑炎发病的分子机制尚未见进一步研究。非编码RNA（non-coding RNA）是一类含量丰富且具有多种功能而不翻译蛋白质的RNA,根据核苷酸长度分为,长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）及短链非编码RNA。lncRNA通常被定义为长度大于200个核苷酸无或少有编码蛋白质的RNA分子,它在生物体内具有多种重要的生物功能。lncRNA位于细胞质或细胞核,可通过顺式作用元件或反式作用元件（又称转录因子）调控近段或远端的编码基因。它通过DNA甲基化、竞争内源性RNA、参与mRNA稳定性和支架蛋白的募集等调控机制参与多种生物过程,可在转录、转录后修饰、蛋白翻译、蛋白修饰以及表观遗传等多个水平上进行分子调控,从而参与体内生物学过程。近年来,在肿瘤性疾病、自身免疫性疾病及神经系统疾病中的研究进展迅速,可作为疾病诊断的生物标志物及药物治疗的潜在靶点。环状RNA（circular RNA,circRNA）是非编码RNA家族新成员,是一类有外显子、内含子或两者的转录本形成的一种具有环状共价闭合结构的RNA分子。circRNAs稳定性高,且具有物种间的高度保守性,具有细胞、组织、发育阶段及疾病的特异性,尤其在终末分化细胞如神经元细胞等高度表达。近年来发现circRNAs与生物体的许多生理和病理过程相关。越来越多的文献报道,circRNA在帕金森病、阿尔兹海默病、多发性硬化、视神经炎等多种神经系统疾病中存在差异表达及一定的分子功能。然而,lncRNAs和circRNAs在自身免疫性脑炎中的作用及临床意义未见相关报道。研究目的探讨非编码RNA在抗NMDAR脑炎患儿与健康儿童外周血白细胞中的差异表达谱及可能的生物学功能,并筛选抗NMDAR脑炎特异性的非编码RNA,以期发现新的抗NMDAR脑炎生物标志物,同时为抗NMDAR脑炎的发病机制研究提供基础线索。研究方法我们根据抗NMDAR脑炎Graus与Dalmau诊断标准（2016年）,共入组了7名确诊抗NMDAR脑炎患儿及7名与患儿年龄、性别匹配的正常儿童的外周血白细胞,然后Trizol法提取外周血白细胞总RNA。选取3名患儿及3名健康对照儿童的血标本,经质检合格后,采用深圳中科普瑞生物技术有限公司的Sino human ceRNA array V3.0 芯片进行 lncRNA、circRNA 及 mRNA 测序,并筛选出差异表达的lncRNAs、circRNAs及mRNAs,对差异表达的lncRNAs cis/trans预测的靶基因和circRNAs母基因进行生物学功能分析,包括GO功能分析和KEGG富集分析,从而推断它们在儿童抗NMDAR脑炎中可能具有的生物学功能及参与的通路。基于非编码RNA可能通过“miRNA海绵”机制发挥作用的理论,我们使用Cytoscape3.5软件预测了显著性差异表达的lncRNA/circRNA所结合的miRNA的位点,进而构建lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA网络,推断与非编码RNA结合力最强的miRNA。同时我们也构建了 lncRNA/circRNA-mRNA共表达网络,推断与lncRNAs和circRNAs有相关关系的mRNAs。最后我们采用qRT-PCR法扩大样本量（7例实验组以及7例对照组）验证芯片数据准确性。研究结果1.通过抗NMDAR脑炎患儿与健康对照儿童外周血白细胞总RNA芯片数据比较,以差异倍数≥2或≤0.5以及P值<0.05为显著性差异表达,一共筛选到894个显著差异表达的lncRNAs,其中469个表达上调,425个表达下调;总共筛选到1195个显著差异表达的circRNAs,其中501个表达上调,694个表达下调。这些显著性差异表达的基因构成了儿童抗NMDAR脑炎非编码RNA的差异表达谱。2.对显著差异表达的lncRNA进行cis/trans靶基因预测,并对靶基因进行GO和KEGG通路分析。其中在NOD样受体信号通路以及Fcγ受体介导的吞噬信号通路中,显著差异表的lncRNAs存在cis和trans调控的共57个,其靶向的且显著差异表达的mRNAs共为82个。3.GO分类富集分析提示显著差异表达的lncRNAs及circRNAs在生物过程方面主要参与生物过程调节、粘附,行为、发育过程、免疫系统过程、细胞组分的组合或生成、移动及对刺激的反应等;在细胞组件方面主要富集到细胞、细胞器及突触等部位;在分子功能方面主要富集到结合和催化活性,信号转导、核酸结合转录因子活性、运输、分子功能调节及分子传感器活性。对lncRNAs和circRNAs在GO条目进行富集,其中lncRNAs富集结果显示在淋巴细胞、中性粒细胞的扩增和分化、T细胞活化等生物功能是显著富集的;circRNAs的富集结果显示在生物过程方面的溶酶体组织、分子功能方面的钙依赖的蛋白结合及细胞组分方面的嗜天青颗粒膜是显著富集的。4.KEGG富集分析发现,显著差异表达的lncRNAs在动物及其他物种的自噬、多物种凋亡及低氧诱导因子-1信号通路等通路中富集明显;在KEGG通路分类富集中,lncRNA富集到神经系统、免疫系统及发育过程等与神经免疫相关的细胞过程,另外在人类疾病相关的通路中神经退行性疾病、感染（寄生虫、细菌和病毒）及免疫疾病是显著富集的。差异表达的circRNAs在内吞、溶酶体、碳水化合物代谢等通路中富集,其中内吞和溶酶体通路是与受体内化相关,另外circRNAs在KEGG通路主要富集的疾病条目为肿瘤、病毒感染及细菌感染。5.在NOD样受体信号通路以及Fc γ受体介导的吞噬通路中构建lncRNA/circRNA-mRNA 共表达网络。lncRNA-mRNA 共表达网络提示 lncRNAs可能通过网络中展示的 mRNAs 如:ARPC2、GABARAPL1、FCGR2B、PYDC1、FCGR2A、MYD88、CXCL2、MFN2、PRKCA、TXN、MAVS、TRIP6、CARD17、CXCL1、PIP5K1B及LA2G4A等在儿童抗NMDAR脑炎中发挥重要作用;该网络图显示显著差异表达的lncRNAs可同时与表达上调或下调的mRNAs存在关联,说明两者可能存在正向或负向相关关系。circRNA-mRNA共表达网络提示差异倍数前20位的circRNAs共有17个circRNAs出现在NOD样受体信号通路以及Fc γ受体介导的吞噬信号通路中,与17个差异表达的circRNAs共表达的mRNA 有:PYDC1、PPAP2B、PIP5K1B、PLA2G4A、TRIP6、PRKCA、DNM1、CXCL2、FCGR2B、FCGR2A、HSP90B1、CXCL1 等 12 个 mRNAs;该网络图显示circRNAs可与多个mRNAs存在相关关系6.IncRNA/circRNA-miRNA-mRNA网络构建显示,在NOD样受体信号通路以及Fcγ受体介导的吞噬通路中显著差异表达的lncRNAs因吸附miRNAs而释放的mRNAs为:MAVS、PRKCA、CXCL2、TRIP6、FCGR2B、FCGR2A、TXN、MFN2、PIP5K1B、CXCL1、ARPC2、PYDC1、GABARAPL1、GABARAPL1 及PLA2G4A,lncRNAs可能通过这些mRNAs分子在儿童抗NMDAR脑炎中发挥了重要作用。差异表达倍数前20位circRNAs在NOD样受体信号通路以及Fcγ受体介导的吞噬信号通路,hsacirc0074239、hsacirc0075949及hsacirc0027275共3个circRNAs分子能吸附miRNAs,其进一步调控的mRNAs为DNM1、PRKCA、RIP5K1B、FCGR2B、FCGR2A、CXCL1、TRIP6、PYDC1、ARPC2、HSP90B1。7.qRT-PCR验证结果示hsacirc 0070185、hsacirc0070976表达上调且与芯片数据一致;hsacirc0042407、hsacirc0081953、hsacirc0039997表达下调且与芯片数据一致。其中hsacirc0042407在实验组中的相对表达量稳定低表达且qRT-PCR结果具有统计学意义,p<0.05。结论1.在儿童抗NMDAR脑炎和健康对照儿童外周血白细胞中,存在大量lncRNAs和circRNAs,且一部分存在显著差异表达。这些显著差异表达的lncRNAs和circRNAs可能参与了儿童抗NMDAR脑炎的发生和发展。2.生物信息学分析显示,显著差异表达的lncRNAs和circRNAs可能通过多种生物过程影响疾病的发生发展。其中lncRNAs主要通过免疫相关通路参与了疾病的发生发展;circRNAs则可能通过受体内化相关通路参与了疾病的发生发展。