基于微流控芯片的量子点探针侦测细胞凋亡研究

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细胞凋亡的检测一直以来是细胞生物学和肿瘤生物学研究领域的一个重要方面,传统的分析与检测手段受到试剂消耗量大、通量较低、操作复杂、费时费力、难以对单细胞进行分析等诸多条件因素的限制。因此,发展新型的高通量、微型化、低消耗、易操作的凋亡检测手段成为人们越来越关注的一个研究领域。微流控芯片技术是一门前沿的新兴交叉学科,它可以为许多的生物学研究提供平台,特别是利用其中的微尺度效应可以为细胞生物学的研究提供很大的方便。生物纳米技术正受到越来越广泛的关注,将这两种技术平台相结合也是目前国际国内研究的热点。尽管如此,许多工作都还处于初级发展阶段,远未达到实际应用的水平,因此纳米技术在微流控芯片领域中的应用还需要进一步的开发与发展。  本论文将微流控芯片技术、生物纳米技术、分析手段有机的结合起来,应用和发展这些方法着重对悬浮性、贴壁性肿瘤细胞凋亡的检测与药物的筛选和在免疫分析方法中的应用开展研究,主要内容如下:  1.基于微流控芯片装置的量子点探针分析悬浮细胞凋亡用于药物筛选的研究  本章提出了一种在微流控装置中能够有效评估抗肿瘤药物及其药效的新方法,该方法应用膜联蛋白Ⅴ(AnnexinⅤ)修饰的量子点作为细胞凋亡检测探针结合微流控芯片装置使细胞凋亡检测和药物效果评估变得快速、简单、有效。该芯片装置采用印刷电路模板(PCB)复制的方法一步制成,其集成了浓度梯度的产生和悬浮细胞的固定培养两部分结构。在该芯片结构中,悬浮的白血病HL-60细胞通过一个合适侧向压力而被恰当地固定在沙袋型微拦坝上来培养。AnnexinⅤ功能化的量子点能够很好的结合在凋亡细胞的表面从而能够方便地在单细胞水平上区分凋亡细胞和非凋亡细胞。较之之前报道的方法,由于采用微流控芯片装置,量子点对凋亡细胞检测的孵育时间从1小时左右缩短到5分钟。该方法对三种模式抗肿瘤药物抗癌效果的评估在细胞群体性和单细胞的动力学水平都有良好表现。该方法将基于量子点的体外细胞成像与微流体系中单个细胞凋亡的分析很好地结合起来,提供了一种简单、易操作的临床抗癌药物的筛选手段。  2.微流控芯片装置内量子点评估药物对贴壁肿瘤细胞毒性研究  本章提出了一种新型的在微流控芯片装置中抗肿瘤药物对三种贴壁性肿瘤细胞毒性的评估方法。我们应用凋亡荧光探针半导体量子点探针Quantum dots-AnnexinⅤ和细胞活性荧光探针分子Calcein-AM酯对细胞进行双染色的方法,在芯片中进行药物对细胞毒性的评估。该方法具有消耗样品量少、操作方便、结果可靠等优势,并且利用量子点荧光探针可以最大程度的减少荧光的漂白对检测结果的影响。Calcein-AM酯对细胞的活性具有很好的指示作用,是量子点探针指示凋亡的良好参照。对结果的染色分析表明,人结肠癌细胞系LOVO对两种抗肿瘤药物依托泊苷和喜树碱具有较高的敏感性,而人乳腺癌细胞系MCF-7对两种抗肿瘤药物具有一定的耐药性,人神经瘤细胞系SH-SY5Y对药物的敏感对结于以上两种细胞之间。  3.基于微流控芯片的荧光免疫分析  本章通过自行设计,采用SU-8光胶作为材料制作芯片模具,发展出了一种可用于免疫分析的微流控芯片装置。所得芯片用荧光素FITC进行表征,可以迅速产生浓度梯度,并在24 h内保持梯度的稳定。免疫荧光表征说明可以在一次实验中实现高通量的免疫测定。该方法可进一步结合纳米材料生物相容性界面作为免疫分析的基底,提高免疫基底对抗体的吸附量,从而达到高灵敏度、高选择性的检测。进一步可以采用量子点作为荧光标记物,利用量子点的抗漂白特性和良好的生物相容性,检测与疾病相关的免疫分析物。该方法有望发展成为一种应对公共卫生事件的现场检测手段。
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