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冠状动脉血栓形成是冠心病心血管事件发生的主要病理基础。在动脉粥样硬化血栓形成前,机体会处于利于血栓形成的高凝病理状态,即血栓前状态。分析冠心病血栓前状态相关的危险因素,探究冠心病血栓前状态的分子机理,可以为冠心病血栓前状态的识别和诊断提供有利的工具,可以有效地干预冠心病血栓前状态,对预防冠心病心血管事件的发生具有重要的临床意义。冠心病血栓前状态是血小板、微循环、炎症反应、凝血状态和纤溶系统等多种因素异常改变综合作用的结果。炎症反应是诱发冠状动脉内血栓形成的关键病理环节。CANTOS临床试验为炎症在动脉粥样硬化中的作用提供了明确的临床依据,心血管疾病进入了一个以炎症为靶向治疗的新时代。因此从炎症反应方面探索血栓前状态发生,对预防冠心病心血管事件具有重要意义。microRNA(miRNA)是一类内源性的进化高度保守的单链非编码小RNA,通过降解、抑制靶基因,影响蛋白翻译,在各种主要的生物过程中发挥重要作用。miRNA可以在冠心病的不同阶段被检测出,参与冠心病的发生及发展过程,因此筛选与冠心病血栓前状态相关的目标miRNA并探究其在血栓前状态中的作用,可为预防冠心病血栓前状态血栓形成提供实验依据和分子靶向。Zedoarondiol是活血化疲中药莪术的有效提取成分,属半杯萜类化合物。既往研究报道Zedoarondiol具有抑制炎症反应的作用,但其抗炎作用机制是否与调控通过相关miRNA进而影响冠心病血栓前状态尚不清楚。围绕以上内容,本课题进行了两方面研究:(1)分析冠心病血栓前状态相关危险因素的临床研究;(2)Zedoarondiol调控血栓前状态相关的目标miRNA干预RAW264.7巨噬细胞炎症模型的效应和作用研究。研究一冠心病血栓前状态相关危险因素分析目的:分析冠心病稳定型心绞痛血栓前状态的危险因素和临床特点,探讨与血栓前状态相关的危险因素。方法:选择行冠脉造影且冠状动脉狭窄程度≥50%的稳定型心绞痛病人115例,通过甲襞微循环和血小板聚集率筛查,纳入冠心病稳定型心绞痛血栓前状态病人50例和非血栓前状态病人65例。对研究对象进行一般临床资料采集和实验室检查,分析冠心病血栓前状态的危险因素和临床特点。结果:冠心病血栓前状态组与冠心病非血栓前状态组临床资料比较发现,冠心病血栓前状态组的TC、TG和hs-CRP水平高于非血栓前状态组,差异有统计学意义(P<0.01)。冠心病血栓前状态相关危险因素的回归分析显示,TC和hs-CRP水平与血栓前状态具有显著相关性,有统计学意义(P＜0.01)。血小板聚集率与各临床参数的双变量相关分析结果显示,TC、TG、LDL-C、hs-CRP与血小板聚集率具有显著相关性(P＜0.01)。冠心病血栓前状态亚组分析结果显示血小板聚集率与hs-CRP水平在冠心病血栓前状态组存在显著相关性(P＜0.05)。结论:本研究通过对冠心病血栓前状态组与冠心病非血栓前组的观察分析,发现TC、TG和hs-CRP可能是对冠心病血栓前状态有预测价值的三个临床参数,其中TC、hs-CRP与血栓前状态具有显著相关性。而作为血栓前状态主要预测因子的血小板聚集率与hs-CRP具有明显相关性,提示炎症反应与血小板活化在冠心病血栓前状态中发挥着关键作用。研究二Zedoarondiol调控miR-34a干预RAW264.7巨噬细胞炎症模型的效应和作用研究目的:研究莪术提取成分Zedoarondiol对炎症反应的作用及对冠心病血栓前状态靶标miR-34a的调控作用。方法:建立LPS刺激RAW264.7细胞的体外炎症模型,进行靶标miR-34a转染实验和Zedoarondiol干预实验并构建双荧光素酶报告基因分析验证Sirtl是否为miR-34a的靶基因。实验分为正常对照组(control)、模型组(LPS)、药物(Zedoarondiol)组(Zed)、miR-34a 组(miR-34a)、miR-34a +Zedoarondiol组(miR-34a+Zed),miR-34a inhibitor 组(miR-34a inhibitor),miR-34a NC 组(miR-34a NC),miR-34a NC+Zedoarondiol 组(miR-34a NC+Zed)和 miR-34a inhibitor NC 组(miR-34a inhibitor NC),共 9 组,每组 5 个样本。Control 组仅加培养基。LPS组培养基中加LPS干预24h。Zed组培养基中加入Zedoarondiol提前干预lh,然后加入LPS干预24h。miR-34a组提前转染miR-34amimic,然后加入LPS干预24h miR-34a+Zed组培养基中提前转入miR-34a mimic,然后加入Zedoarondiol提前干预1h,再加入LPS干预24h。miR-34a inhibitor组培养基中提前转入miR-34a inhibitor,然后加入LPS干预24h。miR-34a NC组提前转染miR-34a mimic NC,然后加入LPS干预24h。miR-34a NC+Zed组培养基中提前转入miR-34amimicNC,然后加入Zedoarondio1提前干预1h,再加入LPS干预24h。miR-34a inhibitor NC 提前转染 miR-34a inhibitor NC,然后加入 LPS 干预24h。干预完成后应用ELISA法检测各组细胞上清液中炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β的表达变化,RT-PCR法检测各组细胞中miR-34a、SirtlmRNA的表达水平,Western-blotting法检测Sirt1和下游通路NFκB/TLR-4的蛋白表达量。结果:与对照组比较,在LPS刺激RAW264.7巨噬细胞的炎症模型中,miR-34a呈高表达(P＜0.05);应用Zedoarondio1提前干预,可以降低炎症模型中炎症因子IL-6、TNF-α、IL-lβ的表达水平(P＜0.05),可以下调模型组miR-34a的水平(P＜0.01),可以升高模型中SirtlmRNA和蛋白的表达(P＜0.01),下降下游炎症蛋白NFκB和TLR4的表达(P＜0.01);与对照组相比,转染后的miR-34a组可显著升高炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β的表达水平(P<0.01),降低Sirt1mRNA和蛋白水平(P＜0.01),升高下游炎症蛋白NFκB和TLR4的表达(P＜0.01,P＜0.05);与模型组比较,转染后的miR-34ainhibitor组下调miR-34a的表达水平(P＜0.01),显著降低炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β的表达水平(P＜0.01),降低下游炎症蛋白NFκB和TLR4表达(P＜0.01)。在转染实验中,与 contro1,转染 miR-34a mimic的样本中miR-34a表达明显高于 miR-34a mimic NC组和control组(P＜0.01),提示转染成功。双荧光素酶报告基因分析显示miR-34a可作用于Sirt1的3’UTR区域,证实Sirtl为miR-34a的靶基因。结论:(1)Zedoarondiol可抑制LPS刺激RAW264.7细胞的炎症反应;(2)miRNA-34a在LPS刺激RAW264.7的炎症模型中呈高表达,抑制miRNA-34a表达可以抑制炎症反应;(3)Zedoarondio1可能通过调控miRNA-34a的靶基因Sirt1和蛋白及下游炎症通路的表达,从而抑制炎症反应。