目的非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是目前较为多见的一种肝脏疾病，是指无过量饮酒史的肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为病理特征的临床病理综合征。NAFLD已成为全球范围内普遍存在的具有流行病学特征的顽疾，是一种越来越引起人们重视和认识的慢性肝病。近年来，关于NAFLD的报道很多，但其发病机制仍不十分清楚，目前“二次打击”学说被认为是统一发病机制学说。初次打击主要是胰岛素抵抗。二次打击主要是氧应激，活性氧的产生增加导致脂质过氧化，细胞因子及Fas配体被诱导活化，从而引起炎症和纤维化。另外，缺氧、内毒素、铁、肝毒药物、CYP2E1伴PPAR-α表达增强等均可作为附加因素，进一步施加多重打击。脂肪酸在非酒精性脂肪肝的发生发展中起着重要的作用，脂肪酸的积聚既是NAFLD的特征表现，也是引起胰岛素抵抗、脂质过氧化、肝细胞损伤、炎症反应、能量代谢障碍等的重要因子。脂肪酸代谢异常贯穿于NAFLD的整个发病过程。目前对于NAFLD肝脏内脂肪酸整体变化的研究极少。本研究复制大鼠NAFLD模型，检测其肝脏组织脂肪酸谱，旨在了解NAFLD大鼠肝脏组织中不同脂肪酸的组成变化，以及这些变化与其他指标的关系，从而探讨脂肪酸代谢在NAFLD发生发展中的变化及起到的作用。材料与方法1．实验动物来源：46只雄性SD大鼠，清洁级，80-100g，由浙江省实验动物中心提供。2．动物模型的建立：雄性SD大鼠按体重随机分层分组：正常对照组饲喂基础饲料。模型组以高脂饲料喂养，即在基础饲料(80.5％)中加入2％高胆固醇、7％猪油、10％蛋黄粉以及0.5％胆盐。分组情况：2月组：正常对照组(正常2月)饲喂基础饲料，加用生理盐水灌胃，第8周末处死。模型组(高脂2月)以高脂饲料喂养，加用生理盐水灌胃，第8周末处死。4月组正常对照组(正常4月)：饲喂基础饲料，8周后加用生理盐水灌胃，第16周末处死。模型组(高脂4月)：高脂饲料喂养，8周后加用生理盐水灌胃，第16周末处死。3．血液检测方法采用日立7600全自动生化仪测定血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、胆碱酯酶(CHE)、总胆汁酸、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)、血糖(FBS)。4．病理学检测：在肝脏最大叶距边缘5mm处取小块肝组织，浸泡于福尔马林中固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察。脂肪变和炎症活动度评分标准参考2004年由Dixon JB提出的标准：脂肪变性，＜5％，0分；＜25％，1分；＜50％，2分；＜75％，3分；＞75％，4分。肝小叶炎症，无，0分；散在3区炎症，1分；轻度3区炎症，2分；明显3区炎症，3分；严重3区炎症，4分。汇管区炎症程度，无，0分；轻，1分；中，2分；重，3分。汇管区炎症范围，无，0分；＜25％，1分；＜50％，2分；＜75％，3分；＞75％，4分。5．能量代谢指标检测：取液氮罐中保存的各实验组大鼠肝组织，采用高效液相色谱法测定其能量代谢物质ATP、ADP、AMP的含量，并计算能荷。色谱条件：以磷酸二氢铵缓冲溶液(pH6.25)为流动相，流动相流速为0.8ml/min，紫外检测波长为254nm，进样量为10μl。标准曲线制备：配制ATP、ADP、AMP标准溶液，以不同的进样量按照上述色谱条件进样分析。以组分质量与相应色谱峰面积作线性回归。结果以保留时间定性，色谱峰面积定量。6．脂肪酸测定：取-80℃低温冰箱保存的各实验组大鼠肝组织，采用气相色谱法测定其脂肪酸含量。采用经典Folch法进行萃取，加C17：0内标混匀，以三氟化硼/甲醇溶液衍生酯化。色谱条件：毛细管色谱柱采用FFAP(30m×0.53mm×0.5μm)及PEG-20m(30m×0.32mm×0.5μm)；载气为氮气(99.999％)；进样1μl；氮气柱前压50Kpa；分流比1/50；尾吹40ml/min；进样器温度240℃；检测器温度260℃；柱温程序升温：初始柱温40℃，保持1分钟，程序升温率6℃/min，升至170℃保持0分钟，再以5℃/min升至240℃保持5分钟。标准曲线制备：各配制6种不同浓度的不饱和脂肪酸标准品和饱和脂肪酸标准品，加入内标液(C17：0)，按上述色谱条件进样分析，分别计算峰面积与内标比值，将这一比值与脂肪酸浓度进行线性回归，得到标准曲线的线性方程。利用色谱工作站(N2000)得到样本各脂肪酸的峰面积，计算各样本不同脂肪酸的含量，并计算U/S(不饱和脂肪酸含量/饱和脂肪酸含量)。结果1．一般指标所有大鼠均测体重、肝脏湿重，并计算肝指数(肝指数=肝湿重/体重×100％)。实验结果显示喂养2月的各组大鼠体重无显著差异，模型组(高脂2月)较对照组(正常2月)肝湿重及肝指数显著升高(P＜0.05)。喂养4月各组大鼠体重亦无显著差异，模型组(高脂4月)较对照组(正常4月)肝湿重及肝指数显著升高(P＜0.05)。同时发现，正常4月组体重明显高于正常2月组(P＜0.05)，高脂4月组体重明显高于高脂2月组(P＜0.05)。2．血清学结果：高脂2月组较正常2月组血清ALT、AST、ALP、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)均显著升高(P＜0.05)，甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白(HDL)明显下降(P＜0.05)。高脂4月组较正常4月组血清ALT、AST、ALP、胆碱酯酶(CHE)、总胆汁酸、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)及血糖(FBS)均显著升高(P＜0.05)，甘油三酯(TG)明显下降(P＜0.05)。正常4月组ALP低于正常2月组(P＜0.05)、高密度脂蛋白(HDL)高于正常2月组(P＜0.05)，其余指标均无显著性差异(P＞0.05)；高脂4月组的总胆汁酸、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)及血糖(FBS)高于高脂2月组(P＜0.05)，ALT、AST亦有一定程度升高，但差异不显著(P＞0.05)。3．病理学检测：肝脏形态学观察：正常饮食组大鼠肝肝表面光滑，红润，无结节，质软。模型组肝体积增大，包膜紧张，呈土黄色，切面油腻，并且随着造模时间延长，两组形态学差异增大。光镜下H．E染色观察正常组大鼠肝脏无1例脂肪肝表现。模型组8周时所有切片均表现为脂肪变性，为弥漫性脂肪变性，肝细胞核相对大小不均。窦细胞活跃，小叶内及汇管区偶而有炎症细胞浸润，较正常组明显增多；16周时所有模型大鼠均出现重度的脂肪变性和大量的炎症细胞浸润，炎症细胞浸润以小叶内为著。参考2004年由Dixon JB提出的标准进行评分。高脂2月组与正常2月组比较，有显著的脂肪变性、气球变性和小叶炎症(P＜0.05)，炎症总分显著升高(P＜0.05)，汇管区炎症不明显。高脂4月组与正常4月组比较，有显著的脂肪变性、麦氏小体形成、气球变性、小叶炎症(P＜0.05)，汇管区炎症程度显著加重(P＜0.05)，炎症总分显著升高(P0.05)。正常4月组与正常2月组相比较，各病理评分无差异(P＞0.05)；而高脂4月组较高脂2月组小叶炎症更为明显(P＜0.05)。4．能量代谢指标测定结果与正常2月组比较，高脂2月组的ATP、ADP、AMP含量无明显改变(P＞0.05)；而高脂4月较正常4月ATP、ADP、AMP含量均显著下降(P＜0.05)。正常4月与正常2月相比，ATP含量无显著差异(P＞0.05)，ADP、AMP含量则有明显升高(P＜0.05)。高脂2月和高脂4月间ATP、ADP、AMP含量无显著差异(P＞0.05)。EC测定结果，各组间均无显著差异(P＞0.05)。5．脂肪酸谱高脂2月组与正常2月组比较，C12：0、C14：0、C15：0、C16：0、C18：0、C18：2、C18：3、C20：0、C22：0、C23：0含量明显增多(P＜0.05)，U/S减小(P＜0.05)；。高脂4月组与正常4月组比较，C12：0、C14：0、C15：0、C16：0、C18：0、C18：2、C18：3、C20：0、C20：4、C22：0、C23：0含量明显增多(P＜0.05)。正常4月组与正常2月组比较，C14：0、C15：0、C20：0增多(P＜0.05)，U/S减小(P＜0.05)。高脂4月组C15：0、C20：4含量比高脂2月组增高(P＜0.05)。6．相关性分析：ALT、AST与U/S呈负相关，ALT与C16：0、C18：0、C18：2、C20：0正相关，ALP与C12：0、C14：0、C16：0、C18：0、C18：2、C18：3、C20：0、C22：0、C23：0正相关，总胆汁酸与C15：0、C16：0、C18：0、C18：2、C20：0、C23：0正相关。总胆固醇、LDL、VLDL均与U/S负相关，甘油三酯与C24：0正相关，LDL与C18：0、C18：2、C20：0正相关。血糖(FBS)与C12：0、C14：0、C15：0、C16：0、C18：0、C18：2、C18：3、C20：0、C20：4、C22：0、C23：0均呈正相关。肝脏脂肪变性、气球变性、小叶炎症、炎症总分与C12：0、C13：0、C14：0、C15：0、C16：0、C18：0、C18：2、C18：3、C20：0、C22：0正相关，气球变性、小叶炎症还与C23：0正相关，汇管区炎症程度与C13：0正相关，汇管区炎症范围与C20：4负相关，脂肪变性、气球变性、小叶炎症、炎症总分与U/S负相关。ATP与C18：0、C18：2、C18：3、C20：0负相关，ADP与C18：3负相关，P＜0.05。AMP、KC与各脂肪酸相关性不强，但大多数呈负相关趋势(P＞0.05)。结论1．大鼠NAFLD肝组织ATP、ADP、AMP含量减少，能量代谢下降，提示肝脏线粒体功能受损，β氧化障碍。2．大鼠NAFLD肝组织饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸含量均显著增多，且血糖水平、肝脏炎症与饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸均正相关。提示大鼠NAFLD肝组织内饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸积聚，脂质代谢异常。饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸在NAFLD形成过程中均有一定的促进作用。3．大鼠NAFLD肝组织C18：0、C18：2、C18：3等与ATP、ADP减少有相关性，提示肝脏脂肪酸积聚可能与能量代谢有一定的联系。