细胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)是一大类涉及到许多内、外源性物质氧化代谢的单加氧酶。根据氨基酸序列符合程度，CYP450分为多个家族和亚家族。其中CYP2C是目前研究最广泛，特性最清楚的亚家族之一。CYP2C包括CYP2C8、CYP2C9、CYP2C17、CYP2C18、CYP2C19几种异构体。CYP2C9酶蛋白在肝脏、肠道和呼吸道等器官组织有表达，但以肝脏表达为主。目前已证实超过100种药物是CYP2C9的底物，约占临床常用处方药物的10～20﹪。CYP2C9代谢的药物在临床应用中常见的有苯妥英、华法林、洛沙坦、托拉塞米、非甾体类抗炎药和磺酰脲类口服降糖药(Sulphonylul-eas，SUs)等。CYP2C9酶基因定位于10q24.2，全长55Kb，包含9个外显子和8个内含子，编码490个氨基酸残基。研究表明，该酶的基因具有高度遗传多态性，目前已发现CYP2C9存在30种等位基因，分别被命名为CYP2C9*1至*30，其中CYP2C9*1为野生型。与野生型比较，大部分CYP2C9突变等位基因的代谢能力有不同程度的降低，而且这些等位基因在不同种族间的分布存在极大的差异。在人群中出现频率较高且对CYP2C9活性影响较大的是CYP2C29*2和CYP2C9*3，其他的突变等位基因在人群中出现频率极低。目前在中国汉族人群中还没有发现CYP2C9*2。携带CYP2C9突变等位基因个体的CYP2C9酶代谢能力与野生型比较显著降低，必然引起这些个体对由该酶代谢药物的药代动力学和药效产生一系列的改变，从而影响其临床疗效和用药安全性。经CYP2C9酶代谢的药物中有许多在临床上广泛使用，因此该领域的研究受到广大医药科研工作者的关注。糖尿病是以高血糖为主要标志的内分泌代谢性疾病，已经成为继肿瘤、心血管疾病之后第三大严重威胁人类健康的慢性非传染性疾病。随着社会的发展，现代的生活方式和社会老龄化等因素使糖尿病患病率逐年上升，其中2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)占90﹪。截止2003年，中国已经成为糖尿病第二大国，拥有4000万2型糖尿病患者，仅次于印度。对于饮食控制和运动治疗无法有效控制血糖的患者需要给予口服降糖药进行治疗。治疗糖尿病的口服药物分为胰岛素促泌剂、α葡萄糖苷酶抑制剂和胰岛素增敏剂等几类。胰岛素促泌剂中的SUs由于作用强、价格低廉等特点，在近半个世纪以来广泛应用于临床。2005年国际糖尿病联盟(IDF)首次发表的治疗2型糖尿病的全球性指南中指出二甲双胍和SUs是基本用药，并且SUs是非超重患者的一线用药。目前临床上常见的SUs有格列吡嗪(Glipizide，GLI)、格列齐特、格列美脲等，在众多的SUs制剂中以GLI控释片的处方量最大。临床使用SUs的过程中发现，SUs产生的降糖作用和低血糖反应等不良反应在2型糖尿病患者中存在个体差异。临床医生需要根据血糖水平对患者多次调整剂量和给药方法才能找到适合患者个人的Sus治疗方案。低血糖反应是SUs最常见的不良反应，约有16.2﹪的患者在服用Sus的过程中曾经出现低血糖反应，严重的低血糖反应可导致休克、癫痫发作甚至死亡。因此，为使用SUs的患者制定个体化的给药方案不仅能够提高SUs的疗效，而且可以降低低血糖反应的发生率。 产生药物效应个体差异的因素有年龄、性别、疾病、遗传因素等，其中遗传因素是决定药物作用的重要因素。随着药物基因组学的发展，许多研究证实了药物在药代动力学和药效学上的个体差异与遗传因素密切相关，其中CYP450基因多态性对药物作用的影响是目前研究的热点之一。相关研究表明Sus在体内通过CYP2C9酶代谢，少量以原形从尿和粪便排出。 本研究以服用GLI控释片的2型糖尿病患者为实验对象，对其进行CYP2C9基因分型；测定GLI控释片的稳态谷浓度、空腹血糖和糖化血红蛋白(HbA<,1c>)，并观察由GLI引起低血糖反应的发生情况。研究CYP2C9基因多态性对格列吡嗪血药浓度和降糖作用的影响，为制定GLI的个体化给药方案提供理论依据。 实验内容： 第一部分：2型糖尿病患者CYP2C9基因多态性的研究 目的： 研究中国汉族2型糖尿病患者CYP2C9等位基因及基因型频率。 方法： PCR扩增跨越CYP2C9基因A1075C位点的DNA片断，采用Nsi Ⅰ酶酶切PCR产物，通过琼脂糖凝胶电泳判断基因型。计算等位基因及基因型频率，并验证是否符合Hardy-weinberg平衡。采用x<'2>析汉族健康人与2型糖尿病患者CYP2C9等位基因及基因型频率的差别。 结果： 中国汉族2型糖尿病患者CYP2C9*1/*1的基因型频率为92.7﹪，CYP2C9*1/*3为7.3﹪，在本研究中未发现CYP2C9*3/*3基因型。2型糖尿病患者的CYP2C9基因型频率分布符合Hardy-weinberg平衡。T2DM患者CYP2C9/3等位基因频率为3.6﹪，与文献报道的中国汉族健康人CYP2C9*3等位基因频率比较没有显著性差异(x<'2>0.035，P=0.852)。 结论：中国汉族2型糖尿病患者人群与健康人群CYP2C9*3等位基因频率和CYP2C9基因型频率没有显著性差异。 第二部分：CYP2C9基因多态性对2型糖尿病患者格列吡嗪血药浓度的影响 目的： 探讨CYP2C9基因多态性对2型糖尿病患者GLI血药浓度的影响。 方法： 在2型糖尿病患者清晨服用GLI控释片前抽取静脉血2mL。血浆经乙醚-正己烷(85：15/V：V)提取后采用高效液相色谱法(HPLC)测定血浆中GLI浓度。对测得的血药浓度用剂量、体重进行校正，采用t检验对不同CYP2C9基因型2型糖尿病患者的GLI标准化稳态谷浓度进行分析。 结果： CYP2C9*1/*1基因型2型糖尿病患者GLI标准化稳态谷浓度为0.215±0.123ng·mL<'-1>·Kg<'-1>·mg<'-1>，CYP2C9*1*3基因型为0.334±0.173 ng·mL<'-1>·Kg<'-1>·mg<'-1>。经两组独立样本t检验分析，不同CYP2C9基因型的T2DM患者GLI标准化稳态谷浓度存在显著差异(t=2.217，P=0.029)。 结论： CYP2C9*3突变等位基因使CYP2C9酶对GLI的代谢活性降低，导致CYP2C9*1/*3基因型2型糖尿病患者GLI稳态谷浓度升高。 第三部分：GYP2c9基因多态性对2型糖尿病患者格列吡嗪降糖作用的影响 目的： 探讨CYP2C9基因多态性对服用GLI控释片的2型糖尿病患者空腹血糖、HbA<,1c>和出现低血糖反应的影响，为制定GLI个体化用药方案提供依据。 方法： 测定符合本研究纳入标准的2型糖尿病患者的空腹血糖和HbA<,1c>;收集患者出现低血糖反应的频率、症状等信息。分别比较不同CYP2C9基因型患者的空腹血糖和HbA<,1c>水平及低血糖反应发生率。 结果： CYP2C*9/*1基因型T2DM患者的空腹血糖水平显著高于CYP2C9*1/*3基因型患者(t=2.097，P=0.045)。CYP2C9*1/*1基因型T2DM患者的HbA<,1c>水平略高于CYP2C9*1/*3基因型患者，两者在统计学上无显著性差异，但在血糖控制效果上存在一定的差别。CYP2C9*1/*3基因型患者相对于CYP2C9*1/*1基因型患者发生低血糖反应的优势比为2.7。 结论： 在服用GLI控释片的2型糖尿病患者中CYP2C9*1/*3基因型患者的空腹血糖水平低于CYP2C9*1/*1基因型患者，CYP2C9基因型对HbA<<1c>无显著性影响。此外，CYP2C9*1/*3基因型患者低血糖反应发生率比CYP2C9*1/*1基因型患者高，但无统计学差异。