研究背景干细胞移植修复损伤组织是当前研究的热点。近年来,大量研究集中于解决如何对移植细胞进行示踪观察。磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging, MRI)可能是无创、在体示踪细胞的最佳手段。众多研究表明,在体外使用超顺磁氧化铁(Supraparamagnetic iron oxide, SPIO)标记干细胞后,借助MRI能无创、活体、实时、准确地对移植干细胞进行示踪成像。SPIO微粒是一种惰性、生物相容性的可生物降解铁。众多研究表明,在一定浓度范围内,SPIO标记对干细胞没有毒性作用,SPIO标记干细胞后并不影响干细胞的活力、增殖力及分化潜能。不过,亦有研究发现,SPIO标记影响干细胞向软骨细胞或骨细胞分化。综上所述,SPIO是否存在潜在的细胞毒性作用仍是一个未解决的问题,需进一步深入研究。SPIO标记对细胞的直接作用是造成细胞内铁超载。已有研究证实,SPIO标记后细胞内铁浓度较正常增加数十至百倍。研究也表明SPIO标记对干细胞向软骨细胞、骨细胞分化的影响与细胞内多余的游离铁有关。所以,目前急需解决的问题是SPIO标记后细胞内铁稳态是否能够维持。铁调节蛋白／铁反应元件系统(Iron Regulatory Proteins/Iron Responsive Elements System, IRPs/IREs系统)是维持细胞内铁稳态最重要的铁调节系统。它主要由转铁蛋白受体(Transferrin Receptor, TfR)、铁蛋白(Ferritin, Fn)和铁调节蛋白(Iron Regulatory Proteins, IRPs)构成,它们在铁稳态的维持中缺一不可。研究发现,SPIO标记细胞后,细胞内Fn表达增加以储存过多的铁,而TfR表达下降以减少对细胞外铁的摄取。不过,亦有研究发现,SPIO标记后细胞内TfR表达增多。TfR是细胞膜上的一种糖蛋白,其主要作用是与转铁蛋白结合介导细胞铁吸收。当细胞内铁缺乏时,TfR表达增多以使细胞外更多铁进入细胞内；反之,TfR表达减少以阻止细胞外铁进入细胞内。TfR高表达于不成熟红细胞、胎盘组织、快速分裂细胞等中。Fn是铁的主要贮存形式,在铁的储存和释放中起重要的作用。在哺乳动物体内,Fn含24个亚基,由铁蛋白轻链(ferritin-L, FTL)和重链(ferritin-H, FTH)构成,且在不同组织中,两者的构成比例不同。FTL和FTH在细胞铁稳态的维持中缺一不可,它们在铁稳态维持中执行不同的功能,且两者的功能不可替换。FTH具有亚铁氧化酶活性,能催化二价铁转换成三价铁,从而利于游离铁进入铁蛋白矿物中心。与此同时,FTH具有显著的抗氧化活性,能减少细胞内活性氧化物的产生,从而阻止后者对细胞骨架的破坏。但是,Cozzi等发现FTH仅是一种铁缓冲剂,其表达量维持在一定水平而不会出现过高表达或过低表达。与FTH不同,FTL不具有催化活性,但其表面含酸性基团,易于铁的水解和矿化。肝细胞等富含铁蛋白轻链的细胞具有很强的铁储存能力。最近研究也发现,细胞内铁浓度改变主要引起的是FTL表达量的改变,而FTH表达受影响不大。因此,了解SPIO标记干细胞内FTL和FTH表达情况对了解SPIO标记后干细胞内铁稳态是否能够维持具有至关重要的意义。干细胞治疗的目的是将干细胞移植到特定的靶器官并分化成特定组织细胞,执行相应的功能。有研究证实MRI示踪观察SPIO标记干细胞的时间可长达21天。研究也发现干细胞在诱导后2-3周已开始分化成相应的组织细胞并执行部分功能。所以,有必要阐明SPIO标记干细胞经诱导分化后,细胞内TfR、FTL和FTH表达的变化情况。研究目的1.探讨转染剂PLL介导SPIO标记大鼠ADSCs的可行性,及PLL介导SPIO标记对细胞活力、增殖力及向心肌样细胞分化的影响。2.探讨SPIO标记对大鼠ADSCs及其心肌样分化细胞内TfR、FTL及FTH表达的影响。3.探讨SPIO标记与TfR、FTL及FTH表达的剂量一效应关系。材料与方法1.大鼠ADSCs的分离、培养无菌条件下切取3周龄雄性SD大鼠腹股沟处皮下脂肪组织,用PBS洗3-4遍后剪碎,并用0.25%Ⅱ型胶原酶消化30-45min,1500rpm离心10min,最后弃上清,用含10%胎牛血清的低糖DMEM重悬、接种,在饱和湿度、37℃、5%CO2的标准环境下培养。原代培养24小时后第一次换液,以后每三天换一次液,待贴壁细胞近铺满瓶底70-80%时,可进行传代培养。2.转染剂PLL介导SPIO标记大鼠ADSCs,并检测SPIO标记率、标记细胞活力和增殖能力本实验使用SPIO试剂为Resovist(Schering公司,德国),原始浓度28mg/ml。无血清培养基中加入SPIO和PLL,室温下置于摇床摇晃混匀30分钟,然后加入到P2代有贴壁干细胞且铺满瓶底近80%-90%的培养瓶内,再加入胎牛血清(终浓度10%)(SPIO终浓度分别为12.5-、25-、50-、75-、100-μg/mL,PLL/SPIO为1：0.03),在饱和湿度、37℃、5%CO2的标准环境下培养过夜(约12小时)。用普鲁士蓝染色定性检测细胞内SPIO标记情况；用台盼蓝试验检测细胞活力；在标记后第1、3、5、7天用MTT试验检测细胞增殖能力,并绘制细胞生长曲线图。3. SPIO标记大鼠ADSCs向心肌样细胞诱导分化取P2代SPIO标记(终浓度35μg/ml)和未标记大鼠ADSCs,接种于六孔板中培养24小时后,每个孔内加入5-氮胞苷(终浓度为9gg/m1),置于饱和湿度、37℃、5%CO2标准环境下的培养箱中培养24小时。然后倒去细胞内培养液,用低糖DMEM+10%FBS的完全培养基培养至第2周,用免疫组化试验检测细胞内横纹肌a-辅肌动蛋白、肌钙蛋白T和I(cTnT、cTnI)的表达情况。4.PLL介导SPIO标记对大鼠ADSCs及其心肌样分化细胞内TfR、FTH和FTL表达的影响本研究使用PLL介导SPIO标记P2代大鼠ADSCs(SPIO终浓度分别为12.5-、25-、50-、75-、100-μg/mL,PLL/SPIO=1:0.03)。在标记后第24小时、7天、21天用Trizol法提取细胞总RNA并用Lysis-M Reagent提取细胞总蛋白。同时设立对照组,即未标记大鼠ADSCs (SPIO终浓度为0μg/mL),将P2代ADSCs分别培养至第24小时、7天及21天后,用相同方法提取细胞内总RNA和总蛋白。然后分别用RT-PCR技术和Western blot技术检测标记细胞及未标记细胞内TfR、FTL和FTH基因和蛋白表达情况。本研究用5-氮胞苷处理SPIO标记(SPIO标记终浓度为35μg/m1)和未标记的大鼠ADSCs.将实验分为四组,即标记未诱导组、未标记未诱导组、标记诱导组和未标记诱导组,分别在施加处理因素(SPIO标记和5-氮胞苷处理)后第7、14和21用Trizol法提取细胞总RNA并用Lysis-M Reagent提取细胞总蛋白,然后分别用RT-PCR技术和Western blot技术检测四组细胞内TfR、FTL和FTH基因和蛋白表达情况。5.统计学方法使用SPSS13.0进行数据统计分析,所有计量资料均以x±s表示。P<0.05时,认为差异有统计学意义。细胞增殖力及FTL、FTH、TfR基因和蛋白表达水平各时间点的比较采用重复测量方差分析；相同时间点,各组之间比较采用单向方差分析并进行两两比较；同一组不同时间点比较采用只有时间点的重复测量方差分析；各浓度组细胞活力比较采用单向方差分析并进行Dunnett两两比较。标记诱导组和未标记诱导组心肌细胞标志物cTnT、cTnI及横纹肌α-肌动蛋白阳性率比较采用两独立样本t检验。结果1.使用0.25%Ⅱ型胶原酶消化大鼠脂肪组织,并经多次换液、传代后,能够在体外成功分离培养出大鼠ADSCs。在原代培养24小时后即可看到贴壁细胞,细胞呈多种形态,以后经过多次换液、传代,细胞数量明显增多,呈典型的成纤维细胞样长梭形外观,且细胞形态较均一、排列有一定方向性。在原代培养6-7天后即可进行第一次传代,以后约3-4天可传代一次,传10代后细胞形态及生长速度仍无明显改变。2.转染剂PLL介导SPIO能简单、高效的标记大鼠ADSCs。当SPIO标记终浓度为12.5μg/ml,细胞SPIO标记率为76.6%4±0.45%,尚有部分细胞未被标记；当SPIO标记终浓度为25gg/ml-100μg/ml时,细胞SPIO标记率达到近100%,且随着SPIO标记终浓度的增加,细胞内蓝色阳性反应区增大、增多。经台盼蓝试验检测,各浓度SPIO标记组及未标记组之间细胞活力差异无统计学意义(F=0.559,P=0.730)。经重复测量方差分析,各浓度SPIO处理与时间间存在交互效应(F=8.587,P=0.000),各浓度SPIO标记组和未标记组组间各时间点细胞增殖能力差异有统计学意义(F=48.246,P=0.000),不同时间点间细胞增殖能力差异有统计学意义(F=3226.026,P=0.000)。3.SPIO标记不影响大鼠ADSCs向心肌样细胞分化。经两独立样本t检验,SPIO标记组细胞与未标记组细胞相比,细胞内cTnT、cTnI及横纹肌α-辅肌动蛋白阳性率差异没有统计学意义(t=0.304、1.011、0.263,P=0.779、0.369、0.807)。4.转染剂PLL介导SPIO标记大鼠ADSCs后,细胞内FTL基因和蛋白、FTH基因表达水平会暂时性升高,TfR基因和蛋白表达水平会暂时性降低。经重复测量方差分析,各浓度SPIO处理与时间间FTH mRNA表达水平不存在交互效应(F=2.027,P=0.059),各浓度SPIO处理与时间间FTL、TfR基因和蛋白表达水平存在交互效应(F=3.055、26.903、7.573、64.16],P=0.003、0.012、0.000、0.000)。各浓度SPIO标记组与未标记组组间FTL基因和蛋白、FTH基因、TfR基因和蛋白表达水平差异有统计学意义(F=246.725、279.895、55.668、169.487、261.018,P=0.000、0.000、0.000、0.000、0.000)；不同时间之间细胞内FTL、TfR基因和蛋白表达水平差异有统计学意义(F=41.170、86.800、26.950、368.709,P=0.000、0.000、0.000、0.000),FTH基因表达水平差异没有统计学意义(F=3.218,P=0.052)。与未标记组细胞相比,各浓度SPIO标记组FTL、TfR基因和蛋白表达水平差异均有统计学意义(P<0.05)。SPIO标记可使细胞内FTL、FTH表达量增多,TfR表达水平降低,且SPIO标记浓度越高,FTL、FTH表达水平越高,但当SPIO浓度达到50gg/ml及以上时,FTH基因表达维持在一定的水平。我们将细胞分为四组,即标记未诱导组、未标记未诱导组、标记诱导组及未标记诱导组。经重复测量方差分析,各处理组与时间间FTL基因和蛋白、FTH基因、TfR基因和蛋白表达水平存在交互效应(F=8.033、26.557、12.730、3.565、73.522,P=0.000、0.000、0.000、0.006、0.000)；四组细胞间FTL基因和蛋白、FTH基因、TfR基因和蛋白表达水平差异有统计学意义(F=61.495、52.743、39.994、137.667、124.594,P=0.000、0.000、0.000、0.000、0.000)；不同时间之间细胞内FTL基因和蛋白、FTH基因、TfR蛋白表达水平差异有统计学意义(F=23.537、79.876、21.603、282.941,P=0.000、0.000、0.000、0.000),TfR基因表达水平差异没有统计学意义(F=0.036,P=0.965)。结合多重比较,标记未诱导组与标记诱导组细胞FTL和FTH基因和蛋白表达水平均高于未标记未诱导组和未标记诱导组,标记未诱导组与标记诱导组细胞TfR基因和蛋白表达水平均低于未标记未诱导组和未标记诱导组；诱导因素(5-氮胞苷)处理后第7、14、21天,细胞内FTL基因和蛋白、TfR基因和蛋白表达水平无明显变化(P<0.05)。结论从大鼠脂肪组织中可成功分离出干细胞。提取的干细胞不但具有间充质干细胞的形态,且具有分离培养简便、体外增殖能力强、生物学特征较稳定等特点。运用转染剂PLL介导SPIO可以简单、高效的标记大鼠ADSCs, SPIO标记后会抑制干细胞增殖,但对细胞活力及向心肌细胞分化能力无明显影响。大鼠脂肪干细胞高表达FTL。在一定浓度范围内,PLL介导SPIO标记可引起大鼠ADSCs内FTL、 FTH表达暂时性增多而TfR表达水平暂时性降低。当SPIO标记浓度达到50μg/ml及以上时,随着SPIO标记浓度的增加,FTL表达量增多,而FTH表达维持在一定水平。所以我们推测,用25μg/ml-50μg/ml的SPIO标记大鼠ADSCs最佳,此时,细胞SPIO标记率达到100%,且细胞内FTH、FTL及TfR表达均会引起相应改变以维持细胞内铁平衡。