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血栓会导致心肌梗塞和卒中.心肌梗塞和卒中是当今世界人类非自然死亡的主要病因之一.在中国,每年因此死亡的的病人达二百万人左右.因此,溶血栓药物的研究具有非常重要的意义.人组织型纤溶酶原激活剂(human tissue plasminogen activator,htPA,通常简写作tPA.)是人体内天然存在的一种可以特异性地激活纤溶酶原从而瓦解血栓的蛋白质.对急性心肌梗塞以及卒中的大规模临床试验显示:迄今,tPA在卒中治疗以及急性心梗治疗方面均是最佳选择方案之一.但是,tPA半衰期很短、溶栓能力及其特异性有待进一步提高.该实验室已经构建了一系列含1-7个突变的tPA突变体以期克服上述缺点,为了充分利用这些成果,该论文的中心目的是:进一步用DNA shuffling方法改良这些已经构建的tPA突变体,建立一个尽可能包含所有7个突变的可能组合的shuffling文库,从中筛选出性质得到改良的tPA突变体.为达到这一目的,我们创建了一个简便的DNA shuffling配套技术平台.这个技术平台主要由以下三种方法构成:1.一种新的不需要PCR过程的DNA shuffling方法.利用某些限制性内切酶切点和识别位点不在一处的性质,通过BbvI酶切-灭活-连接、FokI酶切-灭活-连接这两个步骤完成了亲本分子的碎片化和重新组装这两个步骤,构建了tPA×127PADNA shuffling文库.对文库内后代克隆的基因型分析显示:文库质量良好.2.一种新的多位点突变检测方法.为了快速高效地鉴定tPA突变体的基因型(基因型在此具体指127PA基因中所携带的7个突变的各种组合),基于ASPCR技术,把Taq DNA聚合酶的链置换延伸性质和在不同温度下半引物在模板上退火性质存在差异的特点结合起来,使一管内同时进行的多个ASPCR反应分隔开来,用一个PCR反应便可鉴定出样品中全部7个位点的突变情况.建立的这种新方法,命名为半引物多重ASPCR(hemi-primer multiplexASPCR,HM-ASPCR),用它来对基因型已知的突变体以及随后的shuffling后代基因型的鉴定实验结果显示:该方法可靠,有效.3.一种新的筛选有纤溶活性tPA突变体的简便方法.把测定tPA活性用的纤维蛋白平板溶圈法和毕赤酵母甲醇诱导表达培养方法结合起来,制作了纤维蛋白-甲醇诱导表达平板,来筛选、显示那些其所承载tPA突变体基因具有纤溶活性的毕赤酵母菌株,试验表明:此筛选方法可靠,高效.把上述构建好的tPA×l27PA DNA shuffling文库(127PA含有全部7个突变)转入毕赤酵母,涂布于纤维蛋白-甲醇诱导表达平板上进行筛选,对显示溶圈的克隆用HM-ASPCR进行基因型鉴定.结果显示:28个具有纤溶活性的tPA突变体克隆,共分为18种基因型,其中13种为新的tPA突变体,这13种突变体均含有两个或者两个以上的突变.对这些突变体进行了抗PAI1抑制性质的分析.结果显示:其中两个突变体119PA和124PA表现出明显的PAI1抗性,其抗性分别是天然tPA的37.3倍和34.9倍,这两个突变体的基因型分别是mt2-7(119PA)和mt1、3、5、6、7(124PA).从shuffling文库中筛选到的以这两个突变体为代表的有活性的新tPA突变体还拥有可能会改良其他性质(半衰期延长,特异性提高等等)的突变,对新突变体这些性质的分析检测工作,正在进行中.