一.雷帕霉素对刀豆蛋白A诱导的急性肝损伤的作用及机制目的:观察尾静脉注射不同浓度刀豆蛋白A(ConcanavalinA,ConA)后不同时间点小鼠的肝脏损伤、血清学变化,从而确定造模的最佳剂量与时间。研究Con A对脾脏树突状细胞、巨噬细胞、T、B淋巴细胞表型的影响,从而探讨Con A模拟自身免疫性肝炎的发病机制。进一步探讨雷帕霉素对刀豆蛋白A(Con A)诱导的急性肝损伤的治疗作用,并分析其发挥作用的机制。方法:1.建立急性肝损伤小鼠模型:8周龄雌性C57BL/6小鼠,平均体重20g。按Con A浓度随机分为10 mg/kg、15mg/kg、20 mg/kg三组,分别于注射Con A后的6h、24h、48h随机取6只小鼠,检测小鼠血清生化水平(AST、ALT);肝组织进行HE染色并作出评分。2.雷帕霉素对急性肝损伤的防治作用:随机分为对照组、Con A造模组和Con A造模~+雷帕霉素(RAPA)治疗组。雷帕霉素处理2h后尾静脉注射Con A,24h后检测各组小鼠血清ALT和AST水平;肝组织行HE染色并病理评分。3.流式细胞分析术检测脾脏树突状细胞(DC,MHC-Ⅱ~+CD11C~+)的比例及表面共刺激分子CD40、CD80、CD86的表达情况,同时检测CD4~+T、CD8~+T及CD4~+CD25~+调节性T细胞(Treg)的比例变化及巨噬细胞和B细胞的变化情况。结果:1.随着Con A剂量的增大对肝脏的损伤逐渐加重,10mg/kg剂量对小鼠的肝损伤不显著,可见局部点状坏死。15mg/kg剂量可引起点状或片状坏死。20mg/kg的剂量注射后24小时内小鼠会死亡。Con A组小鼠血清ALT、AST的水平较对照组(PBS组)明显升高,且Con A注射剂量与小鼠血清ALT、AST的水平呈正相关。2.ConA对脾脏免疫细胞的影响主要体现在CD4~+T细胞比例显著上调,巨噬细胞、B细胞、树突状细胞的比例呈升高趋势,且树突状细胞共刺激分子(CD80、CD86)显著上调。3.RAPA治疗组小鼠的血清AST和ALT的水平较Con A组降低,肝脏组织坏死及炎细胞浸润程度较轻;可以下调DC的CD80、CD86共刺激分子的表达,同时降低CD4~+T和CD8~+T细胞占脾脏细胞的比例,并且能够促进CD4~+CD25~+Treg的表达;PAPA对树突状细胞共刺激分子CD40的表达无统计学意义。结论:1.ConA使小鼠脾脏细胞以CD4T细胞浸润为主,B细胞、巨噬细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞的表达有升高的趋势,且使树突状细胞的共刺激分子(CD80、CD86)表达上调。2.雷帕霉素可以减缓Con A诱导的急性肝损伤,主要通过影响T细胞和DC来发挥免疫抑制的作用,为自身免疫性肝炎的治疗提供了理论依据。二.雷帕霉素对自身免疫性肝炎肝纤维化的防治作用目的:通过定量多次尾静脉注射ConA建立小鼠自身免疫性肝炎肝纤维化模型,检测肝脏淋巴细胞表型及CD4~+T细胞的亚型Th1,Th2,Th3,Tr1细胞的变化情况,从而探讨雷帕霉素对其防治作用。方法:1.建立自身免疫性肝炎肝纤维化模型:8周龄雌性C57BL/6小鼠随机分为对照组、Con A造模组、Con A造模~+雷帕霉素(rapamycin,RAPA)治疗组。正常对照组每周一次尾静脉注射磷酸盐缓冲液(PBS),模型组和治疗组每周一次尾静脉注射Con A,三组均连续注射5周。2.评价雷帕霉素的治疗效果:检测各组小鼠血清生化水平;肝脏组织行HE和Masson染色,并行评价肝脏组织炎症及纤维化程度。3.梯度离心法分离肝脏单个核细胞,流式细胞术检测CD4~+T、CD8~+T细胞的比例,并检测免疫细胞内干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素10(IL-10)、转化生长因子β(TGF-β)的表达情况。结果:1.Con A连续注射第5周时开始出现肝纤维化。雷帕霉素治疗组与Con A造模组小鼠相比,血清ALT水平显著降低(p<0.05);肝脏组织炎症损伤明显减轻,并无明显纤维组织增生;2.雷帕霉素治疗组与Con A造模组小鼠相比肝脏单个核细胞内TGF-β的表达显著降低(p<0.05);肝脏CD4~+T和CD8~+T细胞的比例均下调(p<0.05);Th1细胞的比例降低(p<0.05),Th3、Tr1调节性T细胞的比例显著上调(p<0.05),但Th2细胞的差异无统计学意义(p>0.05)。结论:雷帕霉素可以减缓Con A诱导的慢性肝炎肝纤维化的炎症程度,与促进肝脏Th3/Tr1细胞的分化,减少肝脏单个核细胞TGF-β的表达有关。三.雷帕霉素通过诱导免疫耐受性树突状细胞的形成减缓自身免疫性肝炎目的:观察雷帕霉素对树突状细胞(dendritic cells,DCs)的共刺激分子及趋化受体的表达、细胞因子、运动速度、特异性免疫反应及诱导Treg的能力的影响,探讨耐受性树突状细胞在自身免疫性肝炎中的作用机制,同时也为治疗及预防自身免疫性肝病提供新的思路。方法:1.免疫磁珠分选CD11C阳性的树突状细胞,雷帕霉素刺激后流式检测共刺激分子及趋化受体表达况,并利用活细胞工作站观察其动态运动情况。利用Elisa检测上清中细胞因子IL-12,IL-6的表达情况。2.体外诱导实验:将分选的DC与CFSE标记的OT-I,OT-Ⅱ,CD4~+CD25-的T细胞分别共培养,流式细胞仪检测其诱导分化及增殖能力。结果:1.雷帕霉素刺激后的树突状细胞低表达共刺激分子(CD80、CD86)、抑制促炎因子的表达(IL-6、IL-12),符合耐受性树突状细胞的特征。促进DC趋化受体CCR7的表达,并促进其运动速度。2.雷帕霉素抑制特异性反应中CD4~+T和CD8~+T细胞的增殖,并可以诱导CD4~+CD25-的T细胞分化为CD4~+CD25~+的Treg。结论:1.雷帕霉素刺激后的树突状细胞表现为耐受性树突状细胞的特征,同时促进DC趋化受体的表达,并促进其运动速度。2.雷帕霉素降低自身免疫性肝炎的病理损害与抑制CD4~+T、CD8~+T细胞的增殖和诱导CD4~+CD25-的T细胞分化为Treg有着紧密联系。