新城疫(Newcastle Disease, ND)对禽类具有高度的传染性和致病性,世界范围内曾经发生几次大规模流行,对养禽业造成的损失巨大。病原体新城疫病毒(Newcastle Disease Virus, NDV)是单股负链RNA病毒,结构蛋白包括核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、神经氨酸酶-血凝素(HN)和聚合酶蛋白(L)。疫苗接种是目前防控新城疫的行之有效的方法,新城疫疫苗中的弱毒活疫苗具有副作用小、接种方式便捷多样等优点,为养殖户节约免疫时间和人力成本,受到养殖企业尤其是广大偏远散养户的欢迎。本课题组前期进行了NDV V4株的选育工作,获得了耐热低毒且适应BHK-21细胞的TS09-C株,进一步成功构建了TS09-C株的反向遗传操作系统,实现了外源GFP基因在rTS09-C株的插入和表达,这些研究成果为本课题在分子水平继续筛选全长cDNA上合适的外源基因表达位点奠定了基础。参考了相关文献,我们在结构基因NP、M、L的转录起始点分别插入GFP基因,将GFP ORF与病毒结构基因融合转录,同时为了降低GFP插入对结构基因表达的影响,在GFP ORF的5’端加上结构基因转录起始点ATG后的60bp序列,GFP基因与结构基因(SG)整合为融合转录框5’UTR-60Head-GFP-2AUbi-SG-3’UTR,表达后的融合蛋白被裂解为GFP和病毒结构蛋白。本课题中应用限制酶内切pTS09-C质粒,分别获得3个线性化载体,PCR扩增插入序列GFP和2AUbi, In-Fusion连接GFP、2AUbi和线性化载体,获得了3个全长质粒,外源序列的DNA测序结果及全长质粒酶切鉴定结果均与预期相符,说明3个全长质粒构建成功。利用反向遗传操作技术将3个全长质粒分别与辅助质粒共转染BHK-21细胞,在荧光显微镜下检测绿色荧光信号,及时收获阳性信号的细胞,细胞液的HA, real-time PCR和IFA的检测结果均为NDV阳性,Western-Blot检测GFP的结果为阳性,说明表达GFP的NDV拯救成功,按照GFP嵌入位置不同将重组病毒分别命名为rTS-GFP/NP、rTS-GFP/M、rTS-GFP/L,这也是首次利用融合表达自切割方式成功拯救出表达外源GFP蛋白的NDV。本课题比较了3株重组病毒rTS-GFP/NP、rTS-GFP/M、rTS-GFP/L的增殖速率和GFP表达效率。方法是将3株病毒均按0.1MOI病毒量接种BHK-21细胞,接毒后24h、48h、72h、96h时间点分别采集荧光图片、收取培养液上清和受感染的细胞。测定培养液上清的TCID50,并绘制病毒的一步生长曲线,结果显示rTS-GFP/M增殖效率最高,与亲本株rTS09-C基本一致,而rTS-GFP/M和rTS-GFP/L增殖效率都有不同程度降低。绿色荧光强度动态观测图结果显示rTS-GFP/M的荧光强度最高,对受感染细胞的GFP进行Western-Blot检测结果显示rTS-GFP/M的条带最亮,说明rTS-GFP/M既保持了细胞内高增殖特性又可以高效表达GFP,综合比较的结果表明结构基因M转录起始点是较合适的外源基因表达位点。纯化后的rTS-GFP/M株病毒颗粒进行GFP的Western-Blot检测,结果为阳性,表明GFP嵌入到病毒颗粒,激光共聚焦显微镜显示细胞核中也存在GFP,但rTS-GFP/M只存在细胞质中,说明rTS-GFP/M表达的GFP以嵌合和游离两种形式存在。疫苗免疫保护率试验中使用105.0EID50rTS-GFP/M和V4免疫1日龄SPF雏鸡,免疫2周后采血,结果显示rTS-GFP/M组血清HI抗体较低。进行攻毒保护实验,使用106.0EIDso致死剂量NDV强毒CA02,结果rTS-GFP/M组和V4组雏鸡达到完全保护率。综上所述,我们报道了3株表达GFP的NDV,即rTS-GFP/NP、rTS-GFP/M、 rTS-GFP/L,通过比较它们的增殖速率和GFP的表达效率,确定了融合转录自切割方式,在M基因转录起始位点(rTS-GFP/M)是较为合适的外源基因表达位点。免疫rTS-GFP/M后的SPF雏鸡可以完全抵抗NDV强毒攻击,初步表明rTS09-C株重组病毒具有作为耐热疫苗载体的潜力。但是我们发现经过rTS-GFP/M单次免疫1日龄SPF雏鸡,体液免疫应答产生的血清HI抗体滴度较低(1og2<3),这值得我们进一步思考如何对疫苗免疫效果进行评估,或许也说明了疫苗免疫应答反应中,有待进一步研究除了体液免疫之外的保护机制。