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诺如病毒(Norovirus)是急性肠胃炎暴发的常见原因。诺如病毒感染与发展中国家儿童以及免疫力低下或免疫抑制的弱势群体以及其他地区的老年患者的死亡率有关。诺如病毒不同基因型之间观察到的广泛变异可能会影响诊断,因为血清学检测中所用抗体识别的位点可能会由于抗原漂移而发生变化,并且基因组水平的未翻译突变也可能会影响分子诊断检测在引物结合位点发生突变的菌株的能力。诺如病毒感染可引起胃肠道症状,主要是腹泻和呕吐。艰难梭菌感染(Clostridium difficle Infection,CDI)是造成医院内部爆发胃肠道疾病的主要原因,其致病机理为主要通过艰难梭菌产生毒素(toxin A,toxin B,二元毒素)引起伪膜性结肠炎(PMC)和抗生素相关性腹泻。虽然市面上有可用于粪便样本中致病菌提取的试剂盒,但临床粪便样本的预处理和艰难梭菌DNA提取一直尚未标准化。探针法Real-time PCR由于灵敏度高、特异性强、花费时间短等优势广泛应用于临床样本中致病微生物的检测。本论文中,提出了一种快速、便捷提取临床粪便样本中艰难梭菌DNA的方法,并基于探针法Real-time PCR,设计并应用了艰难梭菌双重检测引物与Taq Man探针;最后,将包括临床样本预处理、DNA提取和Real-time PCR检测在内的完整检测体系在一体化检测卡盒中进行了应用。具体研究内容如下:1、粪便样本的预处理和DNA提取步骤的优化使用PBS缓冲液溶解、振荡、离心等步骤对粪便样本进行预处理,除去杂质,保留菌体。并对试剂体积、振荡时间、离心强度、离心时间等做出相应调整,最后得出最适于粪便样本的预处理步骤。对比了市售的6种商业提取试剂盒,从提取成本、操作时间、操作次数和提取效果(下游PCR应用)等不同维度进行综合评估,以在保证效果的前提下优化提取步骤。QG-S试剂盒成本最高,而操作时间最短;SG-B试剂盒成本最低,而操作时间最长。AS-B试剂盒提取的DNA浓度最高,约为83.14±24.95 ng/μL;SG-B试剂盒提取的DNA浓度最低,约为8.24±0.08 ng/μL;SG-B试剂盒(0.86±0.01)和TL-B试剂盒(1.37±0.01)DNA样本的OD值偏离了正常范围。TG-B试剂盒的样本存在蛋白质类污染。在Real-time PCR分析中体现出,QG-S试剂盒的实验稳定性和可重复性最好。将LS-B试剂盒的磁珠与AS-B试剂盒的裂解缓冲液结合使用,可达到从粪便样本中快速提取DNA,优化提取步骤的效果。2、双重C.difficle检测引物探针设计与完整检测体系在卡盒中的应用使用了两种方法设计艰难梭菌双重Real-time PCR检测引物和Taq Man探针,方法一为首先设计双重检测引物,再根据引物的扩增子区域手动设计Taq Man探针并进行应用;方法二为首先对目标序列信息进行分析,截取CG含量较高片段进行引物和探针设计,最终合成引物组合进行特异性测试,评估出特异性最佳的引物组合后,再合成相应的探针并进行应用。其中方法一中所设计的探针应用失败,而方法二中有一组引物探针组合可适用于探针法双重Real-time PCR检测。该引物探针组合在应用于双重Real-time PCR检测时,灵敏度提升,但荧光信号强度略有降低。使用诺如病毒标准品和艰难梭菌粪便样本在一体化检测卡盒中进行了检测应用,诺如病毒标准品标准曲线显示斜率约为-3.4,扩增效率接近于2,说明总体扩增效率较高;而艰难梭菌样品标准曲线显示斜率约为-3.0,扩增效率为2.13,说明扩增效率不太理想。故诺如病毒标准品在卡盒中的检测效率较艰难梭菌样品更高。