根癌农杆菌介导的Pti4基因转化豇豆的研究

来源 :四川农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ncufox
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本研究以‘成豇七号’、‘广东金冠’、‘白沙十七’、‘摘不完白籽泰豆,、‘宏达雪豇豆’5个豇豆栽培品种为材料,探讨不同基因型、不同浓度生长调节剂对豇豆子叶节诱导不定芽和再生的影响,以豇豆子叶节为外植体,建立了豇豆再生体系。以‘成豇七号’为材料,通过农杆菌介导的子叶节侵染和子房原位转化两种方法,将番茄抗病转录因子Pti4基因导入豇豆,并对转化材料进行PCR检测,筛选出转化环节中各影响因子的最佳参数,为豇豆转化提供参考和技术支撑。主要研究结果如下:1.研究了不同浓度6-BA对豇豆子叶节再生整个过程的影响,在豇豆种子萌发阶段,6-BA的添加有利于形成壮苗及促进后期不定芽的诱导,3.0mg/L为最佳浓度;诱导阶段的6-BA最佳浓度为1.0 mg/L,伸长阶段为0.5 mg/L,诱导的不定芽数为5.37个。2.为解决不定芽的伸长问题,在诱导和伸长阶段添加KT,伸长效果显著,最佳浓度为0.06mg/L,和对照相比,在不定芽诱导数和芽长上都有所增加,平均芽数为5.97个,培养4周后的平均芽长为2.62cm。3. 实验同时比较了TDZ前处理的影响,无菌苗阶段添加0.01mg/L TDZ能够达到最佳诱导效果,诱导的不定芽数为5.56个。4. 豇豆不定芽在不添加任何激素的培养基上和添加0.5mg/L IBA的培养基上都能较好的生根,生根率都能达100%,IBA的添加使生根的启动时间由7.5d缩短为6.3d。5.5种基因型的豇豆子叶节不定芽诱导率存在差异,‘成豇七号’、‘广东金冠’优于其它三个品种,芽诱导率分别为95.45%和92.75%,诱导的芽数分别为5.40和5.91个。6. 在农杆菌侵染子叶节的方法中,分别探讨了Kan、Cef对豇豆子叶节再生的影响,TDZ和6-BA前处理、预培养时间、侵染时间、共培养时间及pH等对遗传转化体系建立的影响。确定豇豆子叶节对Kan的抗性浓度为110mg/L,子叶节从无菌苗上切下一周后转入筛选培养基,筛选3周为最佳筛选方式。Cef抑制农杆菌的最佳浓度为200 mg/L。在遗传转化体系建立过程中,TDZ前处理优于6-BA前处理,预培养时间为24h、侵染时间20min、共培养时间2d、侵染液pH为5.8时分别有利于抗性芽的诱导。7.田间用子房原位转化法,选当天开的花,采用花柱全切的方式,以农杆菌菌液侵染子房切口,分别在当天三个时间段侵染,结果发现12点之前处理的花几乎全部脱落,下午3点到6点之间处理的花收获到种子。
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