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抗乳腺癌脂质体具有显著降低包埋药物的毒性、提高瘤内滞留的优势,但在改善患者生存时间上依然存在局限。基于以往对抗肿瘤药物瘤内递送规律深入研究发现,肿瘤微环境异常致使药物难以被递送至肿瘤深层是脂质体疗效不佳的主要原因。针对上述问题,本研究引入具有活血化瘀功效的丹参酮ⅡA磺酸钠化作为“微环境调控剂”,借助课题组前期研究的叶酸化雷公藤红素微乳作为靶向抗肿瘤“主力”,采用分级装配技术构建一种可层次化“靶向-释药”的脂质复合系统。该递药系统在肿瘤外周一级释放丹参酮ⅡA磺酸钠和雷公藤红素微乳:前者修复肿瘤微环境,改善药物递送环境;后者凭借其小尺寸和叶酸化修饰,微乳能够渗透至肿瘤组织深层,并二级释放出雷公藤红素和薏苡仁油,协同并精确地杀伤肿瘤细胞,提高抗肿瘤疗效。本课题在中医药理论的指导下,整合活血化瘀中药和抗肿瘤中药的优势,构建了兼具“肿瘤深层渗透”和“肿瘤精确递送”特性的脂质递药系统,为治疗乳腺癌寻求新突破点,也为中药多组分抗肿瘤脂质体智能化递送提供新思路和新方法。本课题主要研究内容如下:1、叶酸修饰雷公藤红素微乳/丹参酮ⅡA磺酸钠脂质复合系统的制备及理化性质表征本章首先制备出叶酸修饰的雷公藤红素微乳,并对其进行理化性质表征;再对丹参酮ⅡA、雷公藤红素、丹参酮ⅡA磺酸钠等药物进行脂质体工艺研究;最后将叶酸修饰的雷公藤红素微乳与丹参酮ⅡA磺酸钠共同包埋在脂质系统中,多维度表征其理化性质。1.1雷公藤红素微乳(Cel-MEs)与叶酸修饰的雷公藤红素微乳((FA)Cel-MEs)的制备及表征采用一步成乳法制备雷公藤红素微乳与叶酸修饰的雷公藤红素微乳,二者外观均澄清透明,粒径分别为27.32±0.24 nm和38.96±0.32 nm;PDI分别为0.051±0.003 和 0.064±0.008;Zeta 电位分别为-11.0±0.9 mV 和-12.2±1.1 mV;采用透射电镜观察微乳,微乳形态圆整,边缘清晰,分散均匀。1.2丹参酮ⅡA、雷公藤红素、丹参酮ⅡA磺酸钠等脂质体工艺优化及表征分别采用薄膜分散薄膜分散法和逆向蒸发方法、各类型磷脂材料、以及丹参酮ⅡA、雷公藤红素、丹参酮ⅡA磺酸钠等三种包封药物,制备出一系列脂质体,并对脂质-药物之间匹配度进行了分析:雷公藤红素、丹参酮ⅡA磺酸钠采用逆向蒸发法制备的脂质体包封率高于薄膜分散法,两种脂质体制备方法所制备的脂质体包封率为雷公藤红素>丹参酮ⅡA磺酸钠>丹参酮ⅡA;雷公藤红素脂质体用纯度为80%蛋黄卵磷脂(EPC)的磷脂包封率最高,丹参酮ⅡA磺酸钠脂质体用纯度为92%大豆卵磷脂(SPC)的磷脂包封率最高,丹参酮ⅡA脂质体用50%大豆卵磷脂(SPC)磷脂采用薄膜分散法包封率最高。1.3包埋叶酸修饰雷公藤红素微乳和丹参酮ⅡA磺酸钠的脂质体制备及理化表征采用薄膜分散法制备了同时包埋叶酸修饰雷公藤红素微乳和丹参酮ⅡA磺酸钠的脂质复合系统((FA)Cel-MEs/STS-LPs),微乳与脂质材料质量比为1:2和2:1 时,粒径分别98.1±2.4 nm、99.3±1.0 nm;PDI 分别为 0.221 ± 0.012、0.224±0.005。(FA)Cel-MEs/STS-LPs和雷公藤红素/丹参酮ⅡA磺酸钠脂质体(Cel/STS-LPs)体外药物释放均符合一级释药方程:两者在释药初期(0-12 h)药物释放速率较快,中后期(12-48 h)速率放缓直至到达平台期。丹参酮ⅡA磺酸钠在两种制剂中释放速度均大于雷公藤红素,并且丹参酮ⅡA磺酸钠在两种制剂中释放速度相近,48 h累计释放均达到98%以上;雷公藤红素在Cel/STS-LPs中48 h累积释放量显著高于在(FA)Cel-MEs/STS-LPs中的释放量分别为91.5±2.8%、68.3±3.7%。2、叶酸修饰雷公藤红素微乳/丹参酮ⅡA磺酸钠脂质复合系统对人源乳腺癌细胞(MCF-7)、人源肺癌细胞(A549)和人源正常肝细胞(L-02)细胞毒性研究采用MTT法考察了空白脂质体(Blank LPs)、空白微乳(Blank MEs)和包埋空白微乳的空白脂质体(Blank MEs-LPs)对MCF-7及L-02细胞的毒性。Blank LPs 对 MCF-7 及 L-02 细胞的 IC50 分别为 2377.0±425.Oμg/mL、2751.0±566.0μg/mL;Blank MEs-LPs 对 MCF-7 及 L-02 细胞的 IC50 分别为1060.0±105.3μg/mL、718.0±47.4 μg/mL;Blank MEs 对 MCF-7 及 L-02 细胞的 IC50分别为129.0±14.7μg/mL、120.4±12.0μg/mL。此外,采用MTT法考察了游离雷公藤红素(Celastrol)、雷公藤红素微乳(Cel-MEs)、雷公藤红素脂质体(Cel-LPs(SPC))、雷公藤红素混合磷脂脂质体(Cel-LPs(DPPC+SPC))、雷公藤红素和丹参酮ⅡA磺酸钠及薏苡仁油的混合物(Mixture)、叶酸修饰雷公藤红素微乳((FA)Cel-MEs)、Cel-MEs/STS-LPs、(FA)Cel-MEs/STS-LPs 对 MCF-7 及 L-02细胞的毒性。结果表明,各雷公藤红素制剂对人源乳腺癌MCF-7细胞增殖均有明显抑制作用,且与其浓度呈正相关。与Celastrol组相比,Cel-MEs抑制细胞增殖能力明显增强,其24 h和48 h的IC50值分别为1.046±0.132 μM、0.765±0.127 μM;而 Cel-LPs(SPC)和 Cel-LPs(DPPC+SPC)与 Celastrol 相比则无显著性差异:(FA)Cel-MEs、Cel-MEs-STS-LPs 和(FA)Cel-MEs-STS-LPs 与 Mixture各组之间亦无显著差异。同样地,本文还采用MTT法考察了 Celastrol、Cel-MEs、Cel-LPs(SPC)、Cel-LPs(DPPC+SPC)、Mixture、(FA)Cel-MEs、Cel-MEs/STS-LPs和(FA)Cel-MEs/STS-LPs对A549细胞的毒性,各制剂均对A549细胞有明显抑制作用,且与雷公藤红素浓度呈正相关。3、叶酸化雷公藤红素微乳/丹参酮ⅡA磺酸钠脂质复合系统的细胞摄取研究采用异硫氰酸荧光素(FITC)作为荧光材料,采用倒置荧光显微镜和流式细胞仪可视化追踪雷公藤红素制剂在MCF-7细胞中的摄取情况。各组研究结果表明,游离FITC荧光强度最弱,FITC与微乳脂质辅料的混合组FITC-mixture强于游离FITC组。游离FITC荧光强度为33.1±0.5,FITC-mixture荧光强度为119.5±11.6提示一定量的辅料能够显著促进荧光探针进入细胞摄取;而FITC微乳(FITC-MEs)和FITC脂质体(FITC-LPs)细胞摄取量则分别是游离FITC组的39.1和39.4倍;微乳经过叶酸修饰后,细胞摄取量又进一步提高了 2.6倍;将叶酸修饰FITC微乳包埋入脂质体后,细胞摄取量是未用叶酸的修饰FITC微乳脂质体的1.6倍。4、采用流式细胞仪考察各制剂组诱导MCF-7细胞凋亡的情况采用流式细胞仪考察了 Cel、Cel-mixture、Cel-LPs、Cel/STS-LPs、Cel-MEs、(FA)Cel-MEs、Cel-MEs/STS-LPs、(FA)Cel-MEs/STS-LPs 在雷公藤红素浓度为 0.5、1、2.5、5.0μg/mL时诱导MCF-7细胞的凋亡情况。结果显示,各组在诱导细胞凋亡方面存在明显的浓度依赖性:Cel-MEs/STS-LPs、(FA)Cel-MEs/STS-LPs在低浓度凋亡率分别为16.8±2.6%、15.5±1.2%;在中浓度凋亡率分别为在51.6±0.2%、50.3±4.1%;在高浓度凋亡率分别为 59.6±2.3%、81.1±0.2%。剂型也可以显著影响凋亡诱导:含相同雷公藤红素浓度的微乳比其脂质体和脂质复合系统更能诱导细胞凋亡。5、3D瘤球模型培养及雷公藤红素微乳/丹参酮ⅡA磺酸钠脂质复合系统体外肿瘤渗透研究本文采用“liquid overlap”法进行体外MCF-7 3D细胞瘤球模型培养经7天培养后得直径为600～700 μm、外观圆整、结构致密、边缘清晰的3D细胞瘤球模型。采用DiO为绿色荧光探针,可视化追踪DiO微乳(DiO-MEs)、DiO脂质体(DiO-LPs)、包埋DiO微乳的丹参酮ⅡA磺酸钠脂质体(DiO-MEs/STS-LPs)、包埋DiO微乳的脂质体(DiO-MEs/LPs)和DiO微乳与丹参酮ⅡA磺酸钠脂质体混合物(DiO-MEs+STS-LPs)在瘤球内的渗透深度。结果表明,当DiO浓度设定为2.5 μM,考察时间预设为6 h和12 h时,各制剂在细胞瘤球中的渗透均呈现明显的时间依赖性,随着时间的延长,渗透程度越高。6、雷公藤红素微乳/丹参酮ⅡA磺酸钠脂质复合系统体内抗乳腺癌药效学评价6.1 DiD-LPs与DiD/STS-LPs在裸鼠体内的分布情况选用MCF-7荷瘤裸鼠模型考察DiD-LPs与DiD/STS-LPs在裸鼠体内的分布情况。结果显示,腹腔注射DiD微乳及脂质体后,肿瘤部位聚集能力较裸药组均有明显提高,甚至在48 h后,在肿瘤部位仍可观察到微乳和脂质体。其中DiD/STS-LPs组在肿瘤部位聚集最强,其次是DiD-MEs/STS-LPs组,再次是DiD-MEs+STS组,DiD+STS组荧光强度最弱。6.2 Cel-LPs组与Cel/STS-LPs组的体内抗肿瘤药效选用MCF-7荷瘤裸鼠模型,考察Cel-LPs组与Cel/STS-LPs组的体内抗肿瘤药效。体内抗肿瘤结果显示,经过雷公藤红素相关制剂治疗后,相比生理盐水组能够显著抑制肿瘤的生长,尤其是Cel/STS-LPs组肿瘤生长抑制最明显,观察期结束后的离体瘤重最轻。体内免疫学初步研究结果表明,Cel-LPs组与Cel/STS-LPs组的(单核细胞趋化蛋白-1)MCP-1指标相对于生理盐水组均具有显著差异(P<0.05);经Cel-LPs与Cel/STS-LPs治疗后的小鼠血清IFNγ含量未出现裸药治疗后的显著下降情况;其余如IL-2与TGF-β等指标与阴性对照组相比无明显变化。7、雷公藤红素微乳/丹参酮ⅡA磺酸钠脂质复合系统体内抗乳腺癌安全学评价采用全自动生化仪对上述裸鼠肝功能指标AST(谷草转氨酶)、ALT(谷丙转氨酶)、肾功能指标UA(尿酸)、BUN(血尿素氮)、CREA(肌酐)进行测定,并采用全自动血液分析仪对裸鼠全血进行血常规测定。结果显示,各给药组的裸鼠肝功能指标(ALT、AST)及肾功能指标(UA、BUN、CREA)与生理盐水组相比未出现病理性波动。与生理盐水组相比较,各制剂组在白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)及血小板(PLT)等血常规指标无显著性差异。HE染色病理切片结果表明,经Celastrol和Cel+STS治疗的小鼠肝脏出现急性损伤,但Cel-LPs组和Cel/STS-LPs组未出现炎症情况;其余各制剂组在心、脾、肾、肺等组织未见明显病理学变化。基于上述结果,本研究设计的制剂具有较高的抗肿瘤效果和体内安全性。