研究背景和目的2013美国癌症协会的统计资料显示,在美国罹患癌症的发病率以及死亡率中,结直肠癌约占总数的9%,稳居第三位。在男性中其发病率仅次于肺、支气管肿瘤和前列腺癌,而在女性中仅次于肺、支气管肿瘤和乳腺癌。结直肠癌也是我国常见的恶性肿瘤之一,位于恶性肿瘤的第四位。并且随着国民生活水平的提高及饮食结构的改变等,其发病率呈逐渐上升的趋势,而侵袭转移是结直肠癌患者死亡的最主要原因。MicroRNAs(miRNAs)是一类广泛存在于真核生物体内的进化保守的内源性非编码小分子RNA家族,长度约18-22个核苷酸,已报道其在多种肿瘤的发生发展中起重要作用。在转录后水平,miRNA以碱基互补的方式与靶向蛋白编码基因mRNA的3’UTR结合,从而调控靶基因的表达,引起其降解或抑制其翻译。目前已发现近千种miRNAs,在人类基因组中,miRNAs可以调控约1/3的蛋白编码基因,控制了几乎所有的细胞的生命活动,包括增殖、分化、周期、凋亡、代谢以及个体的发育等,并且具有调节肿瘤细胞迁移和侵袭等作用,类似于抑癌或癌基因的作用。研究表明,MicroRNA与多种肿瘤的发生密切相关,如白血病、肺癌、胃癌、乳腺癌和结直肠癌等。miR-101是众多miRNA家族中的一员,是哺乳动物常见序列之一,已经在多种细胞中检测到miR-101的存在。人miR-101有两种前体RNA即:miR-101-1和miR-101-2;分别位于人的1号和9号染色体,长度分别为75bp和79bp,成熟miR-101含21个碱基对。已报道其在肺癌、乳腺癌、前列腺癌、垂体腺瘤、肝癌、胃癌等肿瘤中表达下调,这些说明miR101可能参与了多种肿瘤的发生、转移和侵袭等过程,表明miR-101可能发挥着抑制肿瘤的作用。而miR-101的靶基因也不断被发现,如mTOR、DNA-PKcs、FOS和EZH2等.在临床上,某些miRNA的表达水平可能有助于肿瘤的诊断及其预后评估,同时还能影响药物治疗的敏感性,甚至已经尝试作为新的分子治疗靶点应用于临床治疗。在人体肿瘤中,深入研究miRNA的表达状况及其功能,对研究肿瘤的发生、发展和转移的机制具有重要意义,并将有利于肿瘤的诊断、治疗及预后判断。而miR-101对结直肠癌细胞放敏感性的的影响及机制尚未见报道,值得我们探讨。因此,本课题拟鉴定miR-101在结直肠癌细胞株中的表达特性,并通过改变结直肠癌细胞中miR-101的表达以观察其对肿瘤细胞生物学行为以及对结直肠癌细胞放疗敏感性的影响,为探讨结直肠癌发生、转移机理以及临床治疗提供重要理论依据。研究方法1.miR-101在不同结直肠癌细胞株中的表达采用荧光定量PCR的方法检测了 HT29、LOVO、HCT116、SW480、SW620、LS174T 6株结直肠癌细胞中miR-101的表达。2.miR-101调控结直肠癌细胞的放疗敏感性(1)利用GV209-miR101慢病毒载体;建立稳定过表达miR-101的细胞亚株SW620,脂质体介导转染方法将miR-101抑制物瞬时转染于结直肠癌细胞株SW480,干扰miR-101的表达。(2)利用荧光定量Q-PCR检测miR-101和其候选靶基因RAC1在不同结直肠癌细胞中的表达。(3)利用CCK8法、平板克隆形成实验、细胞周期分析、细胞凋亡等技术和方法分析miR-101对电离辐射前后结直肠癌细胞SW620、SW480的细胞周期、细胞增殖与凋亡等生物学行为的影响。(4)Western blot 实验3.miR-101靶基因的验证及放疗敏感性分子机制的初步研究(1)利用在线生物信息学网站TargetScan、microRNA.ORG和Pictar预测miR-101的靶基因,筛选miR-101的候选靶基因。(2)扩增包含RAC1 3’UTR种子区域的基因片段然后将其业克隆到psiCHECK-2载体,并将此重组载体进行定点突变,构建psiCHECK-2-RACl-Mut载体。采用双荧光素酶报告系统检测RAC1与miR-101的结合情况,确定RAC1是否为miR-101直接调控的靶基因。(3)利用Western Blot检测过表达miR-101的细胞SW620、瞬时干扰miR-101的细胞SW480中靶基因RAC1,以及Cdc42、RhoA蛋白水平的表达。4.统计学分析运用SPSS 13.0统计学软件对实验数据进行统计分析。所有实验数据结构均用均值±标准差的方式表示。荧光定量PCR结果对2-△△Ct值比较用单因素方差分析/One-Way ANOVA。CCK-8体外增殖实验、平板克隆形成实验、细胞周期分析和细胞凋亡分析均使用单因素方差分析/One-Way ANOVA和析因设计的方差分析。方差不齐时运用Welch近似方差分析;方差齐性的多重比较运用LSD法或SNK(Student-Newman-Keuls)法,方差不齐时运用Dunnett’sT3法。双荧光素酶活性检测结果,方差齐性时运用两独立样本t的检验(Independent-Samples T text),方差不齐时运用近似t检验。P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1.miR-101在不同结直肠癌细胞株中的表达荧光定量PCR结果显示,以HT29细胞为参照,5株结直肠癌细胞之间miR-101的表达水平有差异,差异有统计学意义(F=4.647,P=0.000)。Dunnett T3多重比较的统计结果为:miR-101在细胞株Lovo、SW480、SW620的表达存在差异,差异有统计学意义(P<0.05),而在细胞株LS174T与HCT116中的表达无明显的统计学差异(P>0.05)。2.miR-101调控结直肠癌细胞的放疗敏感性(1)利用GV209-miR101慢病毒载体;建立稳定过表达miR101的细胞亚株SW620,荧光定量PCR检测结果表明miR-101在miR101-SW620的表达明显高于其在 GV209-SW620 细胞株的表达(t=-12.775,P=0.012)。过表达 miR-101的细胞亚株SW620构建成功。2株细胞之间RAC1的表达差异有统计学意义(t=13.545,P=0.000);在miR101-SW620细胞株中,RAC1的表达量明显低于 GV209-SW620(P<0.05)。(2)脂质体介导转染方法将miR-101抑制物瞬时转染结直肠癌细胞SW480,干扰miR-101的表达。荧光定量PCR检测干扰后miR-101的表达;SW480-NC与SW480-miR101 inhibitors细胞株之间miR-101的表达水平有差异,差异有统计学意义(t=-3.647,P=0.022)。与 SW480-NC 相比,SW480-miR101 inhibitors中,miR-101的表达水平降低,转染成功。2株细胞之间RAC1的表达水平的差异有统计学意义(t=-20.777,P=0.000);SW480-miR101 inhibitors 细胞株的RAC1的表达量明显高于SW480-NC。(3)利用CCK-8法对不同剂量的X射线处理后miR-101过表达和干扰组细胞生存率的变化进行检测,并绘制生存率曲线。细胞生存率反映了不同剂量放射下细胞的生存能力。SW620、GV209-SW620、miR101-SW620三组细胞分别使用不同剂量射线处理后的生存率水平组间存在着显著性差异,差异有统计学意义(F=1262,P=0.000;F=555,711,P=0.000;F=70.699,P=0.000)。分别使用2Gy、4Gy、6Gy和8Gy同一剂量照射时,SW620、GV209-SW620和miR101-SW620的细胞生存率存在着明显的差异,差异具有统计学意义(F=26.454,P=0.001;F=57.612,P=0.000;F=262.282,P=0.000;F=117.05,P=0.000)。这表明随着X射线照射剂量的增加,细胞的生存率逐渐降低,而在X射线照射剂量相同时,与空白组、对照组相比,miR101-SW620组的细胞生存率明显降低;与空白、对照组相比,miR101-SW620细胞照射后其生存曲线下降更快。进一步表明过表达miR-101之后可能增强SW620细胞对放疗的敏感性。在SW480、SW480-NC、SW480-miR101 inhibitors三组细胞中,分别使用不同剂量射线处理后的生存率水平组间存在显著性差异,差异有统计学意义(F=1221,P=0.000;F=492.815,P=0.000;F=4545,P=0.000)。分别使用 2Gy、4Gy、6Gy 和 8Gy 同一剂量照射 SW480、SW480-NC、SW480-miR101 inhibitors 三组细胞时,3组间的细胞生存率存在着明显的差异,差异具有统计学意义(F=129.202,P=0.000;F=8.766,P=0.017;F=31.635,P=0.001;F=96.548,P=0.001)。结果提示,随着X射线照射剂量的增加,细胞的生存率逐渐降低,而在X射线照射剂量相同时,SW480-miR101 inhibitors组的细胞生存率明显高于空白组和对照组,与空白、对照组相比,SW480-miR101 inhibitors细胞照射后生存曲线下降变慢。这说明干扰miR-101之后可能减弱了 SW480细胞对放疗的敏感性。(4)采用CCK-8法对0GY/4GY X射线照射处理后miR-101过表达和干扰组细胞的体外增殖能力的变化进行检测,并绘制生长曲线。析因方差分析结果显示:SW620、SW480细胞各组生长时间水平具有显著性差异(F=3962,P=0.000;F=23600,P=0.000),细胞增殖能力组间具有显著性差异(F=1250,P=0.000;F=1727,P=0.000),X射线照射处理后细胞增殖能力有显著性差异(F=6245,P=0.000;F=2211,P=0.000)。时间与组间交互效应有显著性差异(F=1433,P=0.000;F=243.141,P=0.000);时间与X射线照射剂量交互效应有显著性差异(F=829.946,P=0.000;F=251.555,P=0.000);组间与 X 射线照射剂量交互效应有显著性差异(F=2820,P=0.000;F=180.773,P=0.000),时间、组间和X射线照射剂量交互效应有显著性差异(F=433.170,P=0.000;F=42.313,P=0.000)。结果表明,在SW620各组细胞中,未给予X射线照射时,与空白组、对照组相比,miR101-SW620组的增殖速度明显降低;与未给予X射线照射处理相比,给予4GY X射线照射处理后,空白组、对照组和miR101-SW620组的细胞增殖速度均明显降低,而miR101-SW620(4GY)组增殖速度最慢。这说明过表达miR-101之后可能抑制SW620细胞的体外增殖能力,miR-101可能增强SW620细胞对放疗的敏感性。在SW480各组细胞中,未给予X射线照射时,与空白组、对照组相比,SW480-miR101 inhibitors组的增殖速度明显增快;与未给予X射线照射处理相比,给予4GY X射线照射处理后,空白组、对照组和SW480-miR101 inhibitors组的细胞增殖速度均明显降低,而SW480-miR101 inhibitors(4GY)组增殖速度下降最慢。这说明干扰miR-101之后可能促进SW480细胞的体外增殖能力,下调miR-101可能减弱了 SW480细胞对放疗的敏感性。(5)平板克隆形成实验SW620细胞空白对照组、GV209-SW620空载组和miR101-SW620组的克隆形成率分别为 0GY:44.33%、48.17%、35.17%;2GY:8.3%、9.5%、4.5%;4GY:2.5%、2.9%、1.28%;6GY:0.60%、0.63%、0.27%;8GY:0.068%、0.085%、0.023%。析因方差分析结果显示:SW620细胞各组克隆形成率水平具有显著性差异(F=166.375,P=0.000)。结果显示,在SW620细胞中,过表达miR-101后,与空白,空载对照组相比,细胞的克隆形成率明显减少,X射线照射SW620各组细胞后,其克隆形成率降低,并且随着X射线照射剂量的增量,其克隆形成率逐渐降低,而过表达miR-101组细胞的克隆形成率减少最为明显。SW620细胞空白对照组、GV209-SW620组和miR-101过表达组的细胞存活率分别为:0GY:1、1、1;2GY:18.72%、19.72%、12.94%;4GY:5.64%、6.03%、3.66%;6GY:1.35%、1.31%、0.77%;8GY:0.154%、0.177%、0.067%。析因方差分析结果显示:SW620细胞存活率放疗剂量水平具有显著性差异(F=27300,P=0.000)。结果显示,X射线照射SW620细胞各组后,各组细胞存活率降低,并且随着X射线照射剂量的增量,其存活率逐渐降低,与空白、空载对照组相比,过表达miR-101组的细胞存活率减少最为明显。运用GraphpadPrism5软件对其分别进行单击多靶模型拟合细胞存活曲线和二次线性模型拟合细胞存活曲线。结果表示,与SW620空白、GV209-SW620空载对照组相比,过表达miR-101后,可能增强SW620细胞对放疗的敏感性,并具有统计学意义(p<0.05)。(6)细胞周期实验利用流式细胞仪技术检测分析过表达和干扰miR-101后对结直肠癌细胞周期的进程是否有影响。结果显示:SW620细胞各组细胞周期G1、S、G2/M分布差异具有统计学意义(F=33.329,P=0.000;F=474.450,P=0.000;F=772.063,P=0.000),与 SW620、GV209-SW620 组相比,miR101-SW620 组出现了 G2/M和G1期周期阻滞(P<0.05)。4GY X射线照射处理后,和SW620、GV209-SW620组相比,miR101-SW620组出现了 G2/M阻滞(P<0.05)。同一组细胞,与放疗处理前相比,放疗后细胞出现了 G2/M和G1期周期阻滞(P<0.0.5)。SW480细胞各组细胞周期Gl、S、G2/M分布差异具有统计学意义(F=176.010,P=0.000;F=233.817,P=0.000;F=1403,P=0.000),与空白组、对照组相比,SW480-miR101 inhibitors细胞出现了 S期周期阻滞(P<0.05)。4GY X射线照射处理后,与空白组、对照组相比,SW480-miR101 inhibitors细胞出现了 S期周期阻滞(P<0.05)。同一细胞,与放疗处理前相比,放疗后细胞出现了 G2/M期周期阻滞(P<0.05)。(7)细胞凋亡实验采用流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示:SW620细胞各组细胞凋亡率差异有统计学意义(F=6115,P=0.000)。与SW620空白细胞组、GV209-SW620组相比,miR-101过表达组的细胞凋亡率增加,同一组细胞,与放疗处理前相比,放疗后各组细胞凋亡率增加,4GY X射线照射处理后,与SW620、GV209-SW620组相比,miR101-SW620组细胞凋亡率明显增加。SW480细胞各组细胞凋亡率差异有统计学意义(F=5419,P=0.000)。与SW480空白细胞组、SW480-NC组相比,SW480-miR101 inhibitors组细胞凋亡率减少,同一组细胞,与放疗处理前相比,4GYX射线照射处理后,各组细胞凋亡率增加,而与SW480空白细胞组、SW480-NC相比,SW480-miR101 inhibitors组细胞凋亡率增加最不明显。(8)Western blot 实验在SW620各组细胞中,随着放疗剂量的增加,γ-H2AX和Caspase-3的蛋白表达水平上调,而同一剂量条件下,与GV209-SW620相比,miR-101过表达组中γ-H2AX和Caspase-3的蛋白水平上调更为明显。3.miR-101靶基因的验证及放疗敏感性分子机制的初步研究(1)利用在线生物信息学预测软件TargetScan、MICRORNA.ORG、PicTar预测miR-101的靶基因,3大网站交集得到多个基因,如:EZH2、FOS、Cox-2、Mcl-1、RHOA、RAC1、BMI-1 等。通过查阅文献,确定 RAC1 作为 miR-101的候选靶基因进行研究。(2)在HEK293A细胞及SW480细胞株中,各自分别共同转染miR101-inhibitors/miR101-NC 和 psiCHECK-2-Rac1/psiCHECK-2-Rac1-Mut。双荧光素酶实验表明,在HEK293A细胞中,miR101-inhibitors可以提高Rac1 3’UTR的荧光素酶活性 30.50%(t=9.725,P=0.001),而 miR101-NC 不改变 Rac1 3’UTR的荧光素酶活性。miR101-inhibitors和miR101-NC对Rac1 3’UTRMut的荧光素酶活性均无影响(t=-0.6580,P=0.3240)。在 SW480 细胞细胞中,miR101-inhibitors可以提高Rac1 3’UTR的荧光素酶活性29.34%(t=4.9410,P=0.008),而miR101-NC不改变Rac1 3’UTR 的荧光素酶活性。miR101-inhibitors和miR101-NC对Rac1 3’UTR Mut的荧光素酶活性均无影响(t=-0.8500,P=0.5460)。说明miR-101可以直接与Rac1 3’UTR结合。(3)Western blot 实验与 SW620、GV209-SW620 相比,miR101-SW620 细胞株靶基因 RAC1 蛋白水平下降。与 SW620、GV209-SW620 相比,miR101-SW620 细胞株中 RHOA、Cdc42蛋白表达下调。与SW480空白细胞组、SW480-NC组相比,SW480-miR101 inhibitors组细胞中,靶基因RAC1蛋白水平上调,与SW480空白细胞组、SW480-NC 组相比,SW480-miR101 inhibitors 组细胞中,Cdc42、RHOA 蛋白表达上调。在SW620各组细胞中,随着放疗剂量的增加,RAC1、Ccd42、RhoA的蛋白表达水平下调,而与GV209-SW620相比,miR-101过表达组中RAC1、Ccd42、RhoA的蛋白水平下降更为明显。结论:1.我们初步证实了在结直肠癌细胞中miR-101直接作用的靶基因是RAC1。2.过表达miR-101能抑制结直肠癌细胞SW620的细胞增殖、克隆形成、促进细胞凋亡和引起细胞G2/M和G1期周期阻滞。下调miR-101的表达后,可以促进结直肠癌细胞SW480的细胞增殖、抑制其细胞凋亡并导致其出现S期周期阻滞。在结直肠癌细胞中,miR-101可能抑制细胞增殖、克隆形成、促进细胞凋亡和引起细胞G2/M和G1期周期阻滞。3.过表达miR-101后可增加结直肠癌细胞的放疗敏感性,其机制可能与其下调直接作用的靶基因RAC1,引起Cdc42、RhoA等基因蛋白水平下调,调控RAC1/Cdc42/RhoA信号通路有关,从而使细胞周期阻滞于G2/M期,并增加细胞的凋亡率。