论文部分内容阅读
目的:Erbin是近年通过酵母双杂交筛选发现的一种新蛋白,属LAP (LRR and PDZ domains)蛋白家族成员,其结构特征为N端含16个LRR结构域,C端含单一PDZ结构域。Erbin最初被认作为ErbB2相互作用蛋白,但近年来的研究发现,Erbin不仅作为细胞骨架蛋白在细胞极性形成、维持上皮细胞内环境的稳定以及ErbB2在细胞中的定位中发挥重要的作用,而且作为一种接头蛋白或信号分子,参与细胞内信号通路的调控。然而,Erbin的生物学功能目前仍未完全阐明。方法:应用免疫荧光染色、共聚焦显微镜观察细胞分裂周期不同时相Erbin的表达特征。通过Western blot和实时定量PCR,分析细胞分裂周期不同时相Erbin mRNA及蛋白水平的表达。通过双荧光素酶报道基因分析观察细胞分裂周期不同时相Erbin启动子活性的变化。通过生物信息学分析Erbin启动子区的潜在顺式作用元件c-Myb。应用染色质免疫沉淀实验和寡核苷酸沉降实验,验证c-Myb与Erbin基因启动子区近端c-Myb反应元件的结合。对c-Myb反应元件进行定点突变、应用特异性shRNA抑制c-Myb表达及通过基因转染技术过表达c-Myb,观察Erbin启动子的转录活性变化。结果:1. Erbin的表达具有细胞周期依赖性应用抗Erbin特异性抗体对人乳腺癌细胞系SKBR3细胞进行间接免疫荧光,发现在间期细胞中Erbin主要定位于细胞膜附近,而在处于分裂期的细胞中Erbin的表达水平明显增强。为验证细胞周期不同时相Erbin mRNA及蛋白水平的变化,我们首先将人乳腺癌细胞系MCF 7细胞用Nocodazole处理16 h,使细胞周期阻滞于G2/M期,于释放后不同时间点,应用流式细胞术分析细胞周期的特征;并于各时间点收集细胞,制备全细胞裂解液及提取细胞总RNA,通过Western blot及RT-PCR分析发现,在G0/G1期Erbin的表达水平最低,S期开始升高,在G2/M期达高峰。2.在G2/M期Erbin的启动子活性明显增高为证实在细胞周期不同时相Erbin转录水平的变化受Erbin启动子活性的影响,我们构建了含系列Erbin启动子5’端截短突变体的报告基因载体,与pRL-TK共转染HeLa细胞,再通过Thymidine双阻断和Nocodazole处理,将转染细胞周期分别阻滞于G1/S交界期和G2/M期。应用双荧光素酶活性分析,观察到Erbin启动子活性在G2/M期明显增高。3. c-Myb及Erbin启动子区的c-Myb反应元件调控Erbin基因转录序列分析发现,Erbin启动子转录起始位点上游-86/-103含有1个潜在的c-Myb结合位点。对该序列进行定点突变后,发现Erbin启动子活性明显降低。染色质免疫沉淀及寡核苷酸沉降实验进一步证实,c-Myb能与c-Myb反应元件特异性地结合。通过基因转染,在Hela细胞中过表达c-Myb,发现Erbin启动子活性明显升高;而应用c-Myb shRNA敲低c-Myb的表达后,Erbin的表达明显受到抑制;进一步通过回转c-Myb,可使敲低c-Myb的细胞重新表达Erbin。结论:1.首次发现Erbin的表达具有细胞周期依赖性的特征。2.首次鉴定Erbin启动子区存在功能性的c-Myb反应元件,c-Myb通过与之结合,调控Erbin启动子的活性。3.本文结果提示Erbin在细胞周期进程中具有未知的功能。