植物组织培养中体细胞染色体数目存在变异现象,已有研究表明,部分植物在离体培养条件下,其染色体多倍化变异往往会随着培养时间的延长而增加。然而,柑橘愈伤组织在长期的继代培养过程中染色体其倍性组成却保持相对稳定,部分愈伤组织在继代10多年后仍然具有较强的胚胎发生能力。本实验室研究推测二倍体愈伤组织中的四倍体细胞在不断产生的同时,以高频率的细胞凋亡方式被淘汰,从而维持四倍体细胞比率的相对稳定。为了验证这一假说,利用带有绿色荧光蛋白标记的‘国庆一号’温州蜜柑(CitrusUnshiu‘Guoqing No.1’Satsuma mandarine)二倍体愈伤组织与经原生质体低密度包埋培养得到的四倍体愈伤纯系进行共培养,研究其相互作用,以四倍体愈伤组织单独培养作为对照,主要研究结果如下:1.对与二倍体愈伤组织混合悬浮振荡共培养的四倍体愈伤组织进行切片形态检测,统计其不同培养时间的凋亡率,TUNEL法检测其在不同培养比率和不同培养质量共培养条件下凋亡率。统计结果表明,共培养和单独培养的四倍体细胞凋亡率均随着培养时间的延长而增加;在不同培养阶段,共培养中的四倍体细胞凋亡率均要高于单独培养,且在培养8d、11d和17d后,存在显著性差异(p＜0.05);随着总培养质量和二倍体比例的增加,四倍体凋亡率也呈递增趋势。2.对悬浮共培养中的四倍体细胞进行半薄切片及其活体核分离,荧光染料DAPI染色观察表明,悬浮培养中发生细胞凋亡的柑橘愈伤细胞具有典型的细胞凋亡特征,包括细胞核中染色质凝聚、片段化和凋亡小体状结构出现。3.分别对混合共培养及单独培养中的四倍体愈伤细胞和二倍体愈伤细胞凋亡率和细胞周期进行分析发现,相对于单独培养,二倍体愈伤细胞凋亡率及细胞周期变化均不存在显著性差异,而四倍体愈伤细胞凋亡率在共培养中显著增加,细胞周期在S期有显著性滞留(p＜0.05),推测混合共培养中的四倍体愈伤细胞通过S期细胞诱导而发生细胞凋亡。4.为了研究四倍体愈伤细胞与二倍体愈伤细胞间的互作是否需要接触,设计了隔离共培养装置。即不同倍性愈伤组织被0.45μm微孔滤膜隔开,不能接触,而悬浮培养液能自由通过,保证不同倍性愈伤组织之间能通过分泌化学物质进行相互通讯。TUNEL检测结果表明,隔离共培养中的四倍体愈伤细胞凋亡率仍然显著性高于单独培养(p＜0.05),表明四倍体愈伤与二倍体愈伤细胞之间相互作用不需要接触,而通过分泌的水溶性化学物质作用。5.为了探寻细胞周期调节蛋白和植物中介导细胞凋亡相关的蛋白是否在四倍体愈伤细胞凋亡中作用,克隆cyclinB2;1,cyclinD3;2,CDKB2;1周期调节蛋白基因和metacaspase1和metcaspas2两个介导植物细胞凋亡的metacaspase蛋白家族基因,并对其表达量进行实时定量分析。结果表明cyclinB2;1,cyclinD3;2和CDKB2;1在隔离共培养中的四倍体愈伤中表达量比单独培养时下降,metacaspase1,metcaspas2表达量则上升。其中cyclinD3;2和metcaspas2表达量存在显著性差异(p＜0.05)。推测,cyclinB2;1,cyclinD3;2,CDKB2;1在四倍体细胞周期调节中作用,且metacaspase1,metcaspas2在四倍体细胞凋亡中作用。6.为了从单细胞水平对四倍体愈伤细胞凋亡进行研究,分离四倍体和二倍体愈伤的原生质体进行相关操作。低密度包埋单独培养四倍体和二倍体原生质对其第一次有丝分裂进行观察,观察结果表明其二倍体与四倍体原生质体均在7d进行第一次有丝分裂。原生质体浅层培养TUNEL检测共培养与单独培养中四倍体和二倍体原生质体凋亡,检测结果表明单独培养及混合培养均可见凋亡细胞。