随着我国的经济和医疗技术的发展,人民生活水平逐渐提高,国民的平均寿命也较过去明显延长。但是人口老龄化带来的一系列问题又反过来妨碍人民生活质量的改善,因此,这是一个充满矛盾而又急需解决的问题。人口老龄化带来的问题,主要体现在老年性疾病的患病率增加,而脊柱退变性疾病则是其中一组患病率极高,又严重影响人们生活的疾病。脊柱退行性改变引起的局部病理解剖学、病理生理学的变化,这些变化的结果不仅可以导致椎间盘功能异常、椎管狭窄,同时还可能影响运动节段的稳定性,出现异常活动,这种异常活动又可以进一步破坏椎间盘的结构与功能,从而加剧椎间盘退变与破坏。椎间盘在脊柱退变过程中最早发生改变的结构,而椎间盘退变是出现各种脊柱退变性疾病如：椎间盘突出症、腰椎退变性滑脱、椎管狭窄症、椎间盘源性疼痛等疾病的病理基础。当脊柱出现以上病变时,脊髓、神经根及马尾神经将受到突出的椎间盘组织、狭窄的椎管挤压,导致出现四肢感觉异常、行走不稳、肌力减弱、大小便障碍等,如受压的神经根发生炎症,或纤维环外层的窦椎神经末梢受炎症刺激,还可出现颈腰痛及肢体放射痛。虽然目前认为椎间盘的退变过程是从人体发育完全后开始的,主要表现为髓核内的水分以及蛋白多糖随着年龄增加而逐渐减少,Ⅰ型胶原蛋白的逐渐增加,致使椎间盘载荷能力随之减低,但是关于椎间盘退变的确切机制目前仍未完全明了,除了知道其跟普遍认同的力学因素、生化因素以及神经生理因素相关之外,还跟免疫反应有密切关系。如细胞因子和炎症介质介导的髓核细胞凋亡、椎间盘内的蛋白多糖含量减少、新生血管的形成等都被普遍地认为在椎间盘退变的过程中发挥着十分重要的作用。新生血管形成在椎间盘退变过程中的作用,目前仍无定论,国内外许多学者认为,椎间盘中新生血管的形成是椎间盘的一种保护机制,因椎间盘内营养物质主要来自上下终板及纤维环的被动扩散,而椎间盘退变开始后,营养物质的被动扩散减弱,机体为了保证椎间盘内的营养供应及修复退变的椎间盘,椎间盘内代偿性生成血管。但是,持反对观点的学者们认为,本无血管的椎间盘内出现血管,使得椎间盘内本来无活性的基质降解酶原从血液中获得激活的因子,从而使椎间盘的细胞外基质发生降解,最终导致椎间盘发生退变。环氧化酶(COX)又称前列腺素内氧化酶还原酶,具有环氧化酶和过氧化氢酶活性,是一种双功能酶,目前发现其有两种同工酶：COX-1和COX-2。其中COX-2是诱导型蛋白,目前已证实其在多种恶性肿瘤内血管形成过程中起上调作用。此外,COX-2还是催化花生四烯酸转化为前列腺素类物质的限速酶。COX-2可通过多条途径促进血管生成,如：上调VEGF、bel-2表达；血栓素A2、PGE2等这些由花生四稀酸代谢代谢而来的产物,可促进血管内皮细胞生长、迁移,诱导血管生成；此外,COX-2还可以抑制血管的内皮细胞发生凋亡。应用选择性的COX-2抑制剂可显著地抑制肿瘤内的血管生成。正常的椎间盘内无血管生成,而退变的椎间盘新生血管则较常见。同时,许多研究证实COX-2因子在退变的椎间盘内表达较正常椎间盘内表达明显增高。那么COX-2因子在椎间盘新生血管形成的过程中是否也有上调作用呢?缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是一种氧依赖转录激活因子,通过与低氧反应元件(HRE)结合,引发下游基因的转录。当哺乳动物的细胞中出现缺氧时,其可诱导机体产生适应性反应,是机体适应低氧环境的重要调节因子。椎间盘发生退变时,营养物质通过终板与纤维环的能力就显著降低,造成椎间盘内部相对缺氧环境,近年来研究表明退变的椎间盘内HIF-1α表达较正常椎间盘内明显增高,并且不同的缺氧程度,表达情况不同。由于肿瘤组织生长十分迅速,其生长速度超过血管生成速度,使其形成局部缺氧环境,诱导HIF-1α表达。研究已经证实,在肿瘤内HIF-1α参与血管形成的全过程：(1)启动阶段,其能通过合成一氧化氮使血管舒张,上调血管内皮生长因子及其配体的表达,使血管的通透性增加；(2)进展阶段,其能增加金属蛋白水解酶的表达,使细胞外基质降解、使血管内皮生长因子诱导血管的内皮细胞发生增生与迁徙,在血管生成素-2的作用下,形成结节状的或者锥体状的血管芽；(3)在形成阶段,其在血管内皮生长因子、血管生成素-1等的作用下,血管芽逐渐生长变形并形成血管腔,在和邻近血管芽吻合成血管网；(4)塑形与改造阶段,其也能在血管生成素-1等的作用下,使血管壁的平滑肌和其他细胞发生迁移,包绕新生成的血管,从而形成完整壁结构。那么在退变的椎间盘内HIF-1α是否也通过相似的途径促进新生血管的形成呢?研究目的COX-2及HIF-1α在肿瘤内表达明显增加,并且肿瘤内血管形成密切相关。在动物退变的椎间盘中有血管形成,而且许多学者认为,椎间盘内血管形成是椎间盘退变的重要因素。同时先前研究也发现在退变的椎间盘内COX-2和HIF-1α这两种因子的表达较正常椎间盘明显增高,但是先前研究并没有联合两种因子做检测及研究其相关关系。所以联合检测并探讨这两种因子在椎间盘内与新生血管形成的关系及这两种因子之间的相关关系,都是本研究的的目的。研究方法选取个3月龄的大白鼠20只(雌雄不限,购自南方医科大学实验动物中心),运用配对比较法随机分成实验组与对照组(在分配动物前,先将大鼠按不同的月龄、性别、胎别和体重等因素配对,以各种因素基本相同的两只动物配为一对,配成10对,每对两只大鼠分别编号为1、2,从随机数字表连续抄录十个数字,从第一个数开始,如为奇数则将第一对动物的1号大鼠编入实验组,2号大鼠入对照组；如为偶数,则将该对动物2号大鼠入实验组,1号大鼠入对照组。如此,将20只大鼠随机分为实验组和对照组各10只)。将实验组10只大鼠手术切除腰1-骶1棘突、关节突,棘上、棘间韧带,切断双侧竖棘肌,然后缝合切口,单独饲养。对照组不行手术,与实验组同等条件饲养。12周后,处死所有大鼠,取腰4/5椎间盘,制成4um厚的病理切片。每个配对中,对照组大鼠的切片通过H-E染色用于跟实验组比较,以反映实验组大鼠椎间盘的退变情况,对照组切片亦行免疫组化染色,但不记录相关数据,仅作阴性对照。通过免疫组化方法检测两组实验动物椎间盘中COX-2、HIF-1α表达情况及CD34标记的新生血管在退变椎间盘及正常椎间盘中表达状况,并计数椎间盘中微血管的密度(MVD),记录实验组相关数据。并通过统计分析描述退变椎间盘中COX-2与HIF-1α之间的关系及它们分别与椎间盘微血管密度(MVD)之间的关系。研究结果1.所有大鼠试验期间全部存活；2.光镜检测结果：对照组大鼠椎间盘组织切片经HE染色后,光镜下可见髓核组织中胶原纤维相互平行排列,纤维粗细较均匀,未见裂隙和囊泡状空腔；而而实验组的椎间盘髓核组织中纤维细胞增生明显,胶原纤维排列紊乱、粗细不均,甚至发生断裂,并可见大量纤维软骨样组织,髓核基质发生玻璃样变性。HE染色片表现为淡红色的细胞团,可见散在的或呈灶状的坏死区,部分坏死物已经发生液化、吸收,残留下大小不一、长短不等的囊泡状、蜂窝状的裂隙和空腔；3.免疫组化染色结果：经免疫组化染色后发现HIF-1α和COX-2在正常的椎间盘髓核中仅有微弱表达,但在退变的髓核内其表达明显增加,COX-2在切片上的染色阳性部位大部分为椎间盘髓核细胞的胞质或胞膜,镜下表现为髓核细胞胞质或胞膜上出现棕黄色的染色颗粒,并且附近大多有新生血管生成。而HIF-1α因子在切片上的染色阳性部位大部分为椎间盘髓核细胞的胞质与胞核,镜下表现为髓核细胞胞质或胞核上出现棕黄色染色颗粒,并且出现染色阳性细胞的部位与表达COX-2的阳性细胞的位置存在明显重叠。用CD34标记的微血管经免疫组化染色后,镜下表现为棕色的单个内皮细胞或内皮细胞簇。在正常的髓核组织中未出现或仅少量出现阳性结果,但是在退变的髓核中其阳性结果明显增多。4.统计学分析结果：将本实验所获数据输入SPSS13.0,经直线相关分析,退变椎间盘髓核组织内COX-2、HIF-1α之间呈显著正相关关系(r=0.705,P=0.023)；用多元线性回归分析COX-2及HIF-1α的表达与MVD呈正相关关系；决定系数R2=0.875,COX-2的标准化回归系数为0.496, HIF-1α的标准化回归系数为0.517。结论本实验利用制作动物模型及免疫组化染色方法,检测大鼠退变腰椎间盘中COX-2、HIF-1α的表达及新生血管密度(MVD)得出以下结论：1. HIF-1α、COX-2在大鼠退变的髓核组织内其表达明显增加；2.大鼠退变椎间盘髓核组织内COX-2、HIF-1α因子的表达呈正相关关系；3.大鼠退变椎间盘髓核组织中MVD值与COX-2因子表达呈正相关关系；4.大鼠退变椎间盘髓核组织中MVD值与HIF-1α因子表达呈正相关关系。