多氧霉素(Polyoxin)是可可链霉菌(Streptomyces cacaoi)产生的嘧啶核苷二肽抗生素,它能够竞争性抑制几丁质合成酶的活性,具有良好的抗真菌活性。多氧霉素不是一种单纯的物质,因为其碳链上R1(结合于嘧啶环上,可以是氢、甲基、羟甲基或者羧基)、R2(位于其中一个氨基酸)和R3(位于另一个氨基酸)三个位点上官能团的变化导致其组份有A～N14种之多。多氧霉素生物合成基因簇在不产多氧霉素的变铅青链霉菌中异源表达,只能检测到H组份(R1位点为甲基)。这表明在多氧霉素生物合成基因簇之外还有修饰基因(氧化基因)在起作用,影响着多氧霉素组份多样性(R1位点)的形成。本研究的任务之一是克隆该氧化酶基因,揭示多氧霉素多组份形成的机制(R1位点)。　　 分析真菌的胸腺嘧啶代谢补偿途径(胸腺嘧啶氧化变成5-羟甲基尿嘧啶、5-醛基尿嘧啶、5-羧基尿嘧啶,然后脱羧变成尿嘧啶),发现补偿途径的出发底物(对应于R1位点为甲基的多氧霉素),代谢中间体(对应于R1位点为羟甲基和羧基的多氧霉素)以及代谢产物(对应于R1位点为氢的多氧霉素)与各种多氧霉素组份的核苷部分一一对应。该胸腺嘧啶代谢补偿途径只在真菌(如粗糙脉孢霉和粘红酵母)中报道有存在,在细菌和其它高等生物中未见报道。BLAST比对从阿维链霉菌中找到了胸腺嘧啶补偿途-径的一个关键酶,胸腺嘧啶-7-羟化酶(Thase,催化胸腺嘧啶氧化变成5-羟甲基尿嘧啶、5-醛基尿嘧啶、5-羧基尿嘧啶),的潜在编码基因SAV4805;从天蓝色链霉菌中找到了胸腺嘧啶补偿途径的另一个关键酶,异乳清酸脱羧酶(IDCase,催化5-羧基尿嘧啶即异乳清酸脱羧变成尿嘧啶)的潜在编码基因SCO_6305。这暗示链霉菌(代表了与真菌处于不同分类地位的细菌)中可能存在有胸腺嘧啶代谢补偿途径。　　 将含有多氧霉素生物合成基因簇的cosmid m5A7在阿维链霉菌(不产多氧霉素)中异源表达,除检测到多氧霉素H组份(R1位点为甲基)以外,还检测到多氧霉素A组份(R1位点为羟甲基)。将阿维链霉菌的开放阅读框SAV4805加载红霉素抗性基因强启动子P-ermE*后与含有多氧霉素生物合成基因簇的cosmid m5A7在变铅青链霉菌(不产多氧霉素)中共表达,除检测到多氧霉素H组份以外,还检测到多氧霉素A组份。这表明阿维链霉菌来源的Thase编码基因SAV4805可以提高多氧霉素生物合成的组份多样性。　　 为测试开放阅读框SAV_4805编码蛋白催化反应的直接作用底物,通过大肠杆菌pET28a/BL21系统超量表达了SAV4805·(His)6融合蛋白,以胸腺嘧啶为底物,参照真菌Thase催化的反应设计反应体系进行体外反应。LC-MS检测没有发现预期底物5-羟甲基尿嘧啶或5-羧基尿嘧啶的产生。鉴于体外生化反应失败的事实,我们想通过喂养实验间接证实开放阅读框SAV4805编码蛋白的催化底物是什么.如果SAV4805蛋白的催化底物是胸腺嘧啶,那么在摇瓶发酵生产多氧霉素的时候添加化学合成的5-羟甲基尿嘧啶和5-羧基尿嘧啶(SAV4805蛋白的预期催化产物)则能够起到开放阅读框SAV4805相同的功能,即提高多氧霉素生物合成组份的多样性。遗憾的是添加5-羟甲基尿嘧啶没有检测到多氧霉素A组份(R1位点为羟甲基)的产生,添加5-羧基尿嘧啶没有检测到多氧霉素F组份(R1位点为羧基)的产生。开放阅读框SAV4805编码蛋白的直接催化底物是什么,还有待进一步研究。　　 通过同源交换敲除阿维链霉菌开放阅读框SAV_4805后,突变株在SFM培养基上能够正常生长,没有发现明显的表型变化。这表明开放阅读框SAV4805是一个奢侈基因,不为阿维链霉菌的生长所必需。为调查开放阅读框sAV4805和SCO6305能否构成一个完整的从胸腺嘧啶到尿嘧啶的补偿途径,本研究通过敲除二羟乳清酸合成酶基因dih打断了阿维链霉菌的UMP从头合成途径。Dih-突变株在培养基中添加尿嘧啶的情况下可以正常生长,否则不能正常生长。将天蓝色链霉菌开放阅读框SCO_6305加载红霉素抗性基因强启动子P-ermE*后导入dih-突变株,创建一个嘧啶代谢补偿途径。但是携带创建的嘧啶代谢补偿途径的dih-突变株在培养基中添加胸腺嘧啶的情况下仍然不能正常生长,这表明创建的胸腺嘧啶代谢补偿途径不能正常工作,即胸腺嘧啶不能成功被转化成尿嘧啶。分析认为这可能是因为SAV4805蛋白的氧化能力不如Thase,嘧啶环上的7为甲基只能被氧化成羟甲基不能被氧化成羧基,因为sAV4805提高多氧霉素生物合成的组份只能检测到R1位点是羟甲基的A组份,没有检测到R1位点是羧基的F组份。或者,SAV4805蛋白的直接催化底物是TMP而不是胸腺嘧啶。具体原因尚待进一步研究。