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脂肪酶(EC 3.1.1.3)是一类丝氨酸水解酶,催化甘油三酯的水解,将其转化为甘油和脂肪酸。相对于传统催化剂,脂肪酶表现出许多重要的优势,如界面催化、对映体选择性等,广泛应用于食品、纺织和医药行业,其中低温脂肪酶由于其在低温下的高催化活性和选择特异性逐渐受到大家的关注。课题组前期研究筛选到的嗜冷杆菌Psychrobacter sp.ZY124,能够产生低温脂肪酶Lipase ZC12,该酶具有较高的低温催化活性、温度稳定性及有机溶剂耐受性,表明低温脂肪酶Lip ZC12具备良好的应用开发潜力。本论文围绕Lip ZC12空间结构,研究了“盖子”(lid)结构域对底物结合能力的影响,分析了底物进出活性口袋路径的空间位阻对催化效率的影响,实现了 Lip ZC12的理性改造;同时,通过有机-无机杂化纳米花的形式固定Lip ZC12,增加Lip ZC12在反应中的稳定性;通过果糖月桂酸酯的酶促合成研究不同方式改造后的Lip ZC12酯化能力,进一步探讨Lip ZC12及改造酶的应用潜力。(1)为了弥补低温脂肪酶培养周期长,产酶量低的不足,基于所获得的完整Lip ZC12基因序列,对该低温脂肪酶进行重组表达。序列分析表明,Lip ZC12为lipase family 1.1家族,催化三联体的残基为Ser144、His324和Asp302,氧负离子洞由Leu77和Gln145组成。构建的重组质粒pET28a(+)-lip,重组Lip ZC12在E..coliBL21(DE3)中获得可溶性表达。酶学性质研究表明Lip ZC12最适作用温度为40℃,最适作用pH值为8.0,具有有机溶剂耐受性。与lipase family I.1家族中假单胞菌脂肪酶一样,Lip ZC12也具有Ca2+激活作用。(2)基于以上低温脂肪酶Lip ZC12的酶学特性以及序列特征,为了提高低温脂肪酶底物亲和力和催化效率,分析Lip ZC12结构特点发现,与同源性较高的其他脂肪酶相比,Lip ZC12在lid结构域非保守性区域特异性增加了 8个氨基酸(NTSGQPSN)。为了探究lid结构域对酶功能的影响,通过重叠PCR方法获得截短Lip ZC12“盖子”结构域,获得了重组质粒pET28a(+)-Alid,重组表达的改造脂肪酶lip-Alid的Km值为9.02× 10-3 mol·L-1,显著低于改造前天然脂肪酶Km值(13.12×10-3 mol·L-1),说明截短lid结构域可显著提高底物结合能力。同时,底物进出活性口袋的路径会影响酶的催化效率,需要对该路径中空间位阻较大氨基酸进行改造;通过生物信息学方法找到关键氨基酸Phe144,对其进行定点突变获得重组质粒pET28a(+)-F144A/V,突变后的lip-F144A/V脂肪酶Km基本不变,而kcat值分别为1436 s-1和182]s-1,其中lip-F144V的kcat/Km值比天然脂肪酶提高1.5倍,说明减小底物通道空间位阻可显著增强脂肪酶的催化效率。(3)为了进一步提高低温脂肪酶的稳定性、实现其可重复利用性,基于Lip ZC12具有Ca2+激活特性,制备了一种新型Lip ZC12/Ca3(PO4)2杂化纳米花(LHNs(Ca))固定化酶。形貌特征发现固定化脂肪酶纳米花是片层堆叠成花瓣状结构的稳定纳米颗粒,其分布均匀,直径约2-5 μm。通过对其结构进行表征,发现LHNs(Ca)存在唯一金属晶体Ca3(PO4)2以及脂肪酶有机组分,没有其他共价键结合,这说明成功制备自组装形式的纳米花LHNs(Ca)。与游离脂肪酶相比,LHNs(Ca)的酶活性提高至206%,kcat/Km值提高到2.31倍,尤其是在低温下具有更高的比活性,说明LHNs(Ca)表现出更好的底物亲和力以及更高的催化效率。连续7次循环使用后,LHNs(Ca)仍可以保持其初始活性,表现出比游离脂肪酶更高的稳定性及可重复利用性。采用相同的固定化方法对lip-Δlid、lip-F144A 和 lip-F144V 分别进行固定化,LHNs(Ca)-lip-Δlid 的kcat/Km 值提高了 3.11 倍。(4)由于理性改造和固定化均提高了脂肪酶的催化效率,为了进一步研究其催化能力及应用领域,以丙酮为反应溶剂,果糖和月桂酸为底物,酶促合成果糖月桂酸酯。结果表明,LHNs(Ca)、LHNs(Ca)-lip-Δlid、LHNs(Ca)-lip-F144A 和 LHNs(Ca)-lip-F144V均能够催化酯化反应,产物经过分离纯化后进行定性分析,特征峰和官能团鉴定,确认产物为果糖月桂酸单酯和果糖月桂酸二酯。通过优化酯化反应条件,确定该反应在40℃、果糖:月桂酸摩尔比为2:3时反应72 h获得最大转化率。在相同条件下,比较4种形式的脂肪酶的催化效率,结果表明LHNs(Ca)-lip-Δlid在48 h的转化率(58.36%)显著高于LHNs(Ca)转化率(41.73%),这进一步说明通过固定化修饰和“盖子”截短改造,Lip ZC12改造酶稳定性和酶活力均有显著提高。综上所述,本论文构建低温脂肪酶重组表达菌株,获得可溶性脂肪酶。截短lid结构域和减小底物通道空间位阻分别显著提高理性改造脂肪酶Lip ZC12的底物亲和力以及催化效率。同时,采用一种新型杂化纳米花的形式固定该脂肪酶,LHNs(Ca)表现出更好酶活力以及更高的稳定性,完成了果糖月桂酸酯的合成,有效实现低温脂肪酶的应用开发价值。