论文部分内容阅读
褐飞虱是重要的水稻害虫,每年对粮食生产带来了巨大的损失。褐飞虱与水稻存在协同进化,含有致害基因的褐飞虱也容易发生变异,对水稻造成严重的危害。因此,通过分子手段和细胞学手段,对变异褐飞虱的亲缘关系研究意义重大。本研究从ITS序列,重复序列,染色体数目几个方面对褐飞虱遗传基础进行了研究。具体内容如下:1,通过提取DNA以及PCR扩增褐飞虱ITS序列的方法来得到褐飞虱属相关种的ITS扩增产物,经克隆测序而得到他们的碱基序列,在NCBI上对数据的可靠性进行检验后通过Clustal X对不同来源的褐飞虱ITS序列进行比对,利用软件DNASPversion对碱基组成和变异位点进行了统计,用MEGA4.0对上述序列进行了碱基含量的分析、多态位点分析以及进化树的构建,并用RNAstructer软件对其ITS1和ITS2二级结构进行了预测。结果发现:生物型3（A）、生物型1（T）、生物型2（M）、李氏禾褐飞虱（J）四种生物型的褐飞虱亲缘关系紧密,它们与拟褐飞虱（N）和伪褐飞虱（L）相比较而言,与拟褐飞虱（N）的亲缘关系较近。通过多序列比对发现,在其ITS1序列中存在3处较大的变异。相对于ITS1来说ITS2较为保守,没有大片段的插入缺失,多为单碱基的变异。3种褐飞虱的ITS1有三种构型,同一个种的不同生物型之间ITS1构型一致。3个种的ITS1的二级结构都由4个臂区和1个中间环组成。3种褐飞虱的ITS2二级结构差异较大,有四种构型,但是褐飞虱的4个生物型的ITS2二级结构都由6个臂区和一个中间环组成,拟褐飞虱由5个臂区和1个中间环组成,伪褐飞虱由4个臂区和一个中间环组成。对褐飞虱各种之间的亲缘关系与进化关系的研究不仅对褐飞虱的种属关系得到了更为全面的认识,更重要的是对水稻危害的防治的研究也具有非常重要的意义,因为ITS1、ITS2参与核糖体的构成,调控特定的反应,对基因的转录,翻译都有一定的影响。2,利用重悬法对田间褐飞虱（主要为生物型2（M））幼虫进行了有丝分裂染色体和减数分裂染色体的制备,观察,统计以及相应的分析,结果发现褐飞虱染色体数目为30（2n=28+XY）条,有些细胞会有染色体的丢失（亚倍性）,在亚倍体中丢失一条染色体的概率较大。通过统计发现,亚倍性要多于假多倍性。XY染色体分布在常染色体组成的中空环的边缘,X染色体交Y染色体长,长度约为其2倍。X染色体相对长度为6.81,Y染色体相对长度为3.44,在染色体组长度的排名中分别占据第6位和第15位。最长的和最短的染色体的比值（染色体长度比）为3.13。通过对褐飞虱染色体有丝分裂和减数分裂时期的细胞学特征的研究了解到了褐飞虱的遗传关系,为此物种遗传分离和繁殖行为现象解释提供非常重要的线索或依据,并掌握了基本的核型情况。3,对褐飞虱生物型1（T）基因组进行了Solexa高通量测序,随机挑选了5100万个读长的末端进行分析,通过Novak等的相似碱基读长聚类方法对重复序列进行了鉴定,并通过BMC生物信息学软件对重叠读长进行聚类（分组）。通过分析得到的重复序列,在NCBI的primer-BLAST中获得相应的引物序列。对基因组DNA进行扩增,获得相应的串联重复序列,并以此进一步合成探针,在生物型2（M）染色体上进行定位。荧光原位杂交实验结果表明,CL33在染色体上有4对杂交信号,CL38,CL13在染色体上有2对杂交信号,CL55,CL62在染色体上有1对杂交信号。CL33的4对杂交信号有2对位于染色体对的末端,2对位于染色体的近着丝粒处。CL13,CL38,CL55,CL62的杂交信号位于染色体的末端。CL13,CL33,CL38,CL55,CL62占总染色体组的百分比分别为14.96%、2.11%、8.88%、5.56%、1.69%。将测序所得的序列经过NCBI比对之后发现,CL33中有部分序列与褐飞虱ag-75克隆微卫星序列以及irp2 mRNA胰岛素相关多肽2部分片段重叠。CL13中有部分片段与锥蝽克隆TDAK76以及TDAK51微卫星序列部分片段重叠。cl38中有61bp的序列与褐飞虱中隔离NLMSRDA11甲基化片段的基因组序列相同,68bp-125bp与褐飞虱中隔离NLMSRDA4甲基化片段的基因组序列部分片段相似度达86%。CL55中有部分序列与野猪BAC克隆KNP1159H5以及阿里山潜蝇茧蜂的跨膜9超家族成员2的转录变异X2的mRNA部分片段重叠。CL62中有部分片段与转移功能有关的家族1成员3（mta3）的转录变异X3的mRNA的部分序列重叠。