论文部分内容阅读
目的从骨髓组织中分离培养骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells MSCs),并进行纯化和鉴定从而获得可靠的MSCs细胞株;研究MSCs向胶质瘤细胞趋化迁移的能力、胶质瘤细胞对MSCs细胞表型的影响、PDGF在MSCs向胶质瘤定向迁移过程中的作用。方法(1)采用全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠和人MSCs,倒置显微镜下观察细胞形态与排列方式,流式细胞仪鉴定MSCs细胞表面标志物,MTT法测定细胞细胞生长曲线。(2)利用Transwell体外趋化迁移模型评估MSCs向胶质瘤细胞趋化迁移能力。(3)大鼠MSCs分别与C6胶质瘤细胞共培养和利用C6胶质瘤细胞条件培养基进行诱导培养,倒置显微镜观察上述方法培养后MSCs的形态学变化,细胞免疫荧光染色上述培养后MSCs细胞表型的改变。(4) RT-PCR检测MSCs细胞PDGF受体PDGFR-α和PDGFR-β的表达情况。(5)利用Transwell细胞迁移模型,观察PDGF是否具有吸引MSCs定向迁移能力、不同浓度PDGF对MSCs定向迁移能力的影响、PDGF在MSCs趋胶质瘤性迁移过程中的作用。结果(1)在大鼠和人骨髓中均成功分离出MSCs,细胞为长梭形,呈典型的漩涡状排列,大鼠MSCs细胞表面标志物:CD90、CD105呈阳性表达,人MSCs细胞表面标志物:CD44、CD90呈阳性表达,CD34、CD45呈阴性表达。MTT法检测结果显示不同代细胞的增殖特性相似,传代第3天进入指数增长期,随着传代细胞的生长状况有衰减趋势。(2) Transwell体外趋化迁移模型证实胶质瘤细胞培养上清具有吸引MSCs定向迁移作用。(3)细胞免疫荧光染色结果显示,与胶质瘤细胞共培养或经胶质瘤条件培养基诱导培养后,MSCs表达血管内皮细胞标志物Ⅷ和KDR。(4)RT-PCR检测表明人MSCs细胞表达血小板衍生生长因子受体PDGFR-α和PDGFR-β。(5)体外趋化迁移实验结果显示不同浓度的PDGF吸引MSCs迁移的细胞数均较空白对照组有显著性差异,而且浓度越大,迁移的细胞数越多(P＜0.05);U87胶质瘤细胞培养上清能够吸引MSCs定向迁移,迁移细胞数明显多于空白对照组,有显著性差异(P＜0.05);在U87胶质瘤细胞培养上清内加入PDGF抗体后MSCs定向迁移能力明显减弱(P＜0.05),但仍强于空白对照组。结论(1)通过全骨髓贴壁培养法可以获得较为纯化的MSCs细胞株,并且可以通过液氮冻存保存细胞,不同代MSCs具有相似的增殖周期。(2)胶质瘤细胞培养上清具有吸引MSCs发生定向迁移的作用。(3)胶质瘤细胞分泌可溶性细胞因子诱导MSCs分化为血管内皮细胞样细胞,可能参与肿瘤新生血管的形成,这也可能是MSCs趋胶质瘤性迁移机制之一。(4) MSCs表达PDGF的受体,PDGF与其受体相互作用,以浓度依赖方式吸引MSCs定向迁移。PDGF在MSCs向胶质瘤选择性迁移过程中发挥“趋化因子样”作用。