论文部分内容阅读
目的： 建立超高效液相串联质谱法快速测定铜丝藤根水煎液中主要化合物成分：对香豆酸、金合欢素、芹菜素、蒙花苷和香叶木素-7-O-Β-D-葡萄糖苷的含量。方法：称取铜丝藤根干燥药材粉末制备成2g生药/mL的水煎液，并加入甲醇-水混合溶液经过超声和补齐减少损失的重量，再用0.22μm微孔滤膜滤滤过，即为铜丝藤根水煎液供试品溶液。使用ACQUITY UPLC BEH C18 (50mm×2.1 mm, 1.7μm) 色谱柱；流动相为乙腈-0.1%甲酸水：流速为 0.4 mL·min-1；采用梯度洗脱法。使用正离子多离子反应监测（MRM）扫描，定量离子对为：对香豆酸 m/z 164.96→146.99；金合欢素m/z 285.09→242.06；芹菜素m/z 443.01→281.05；蒙花苷m/z 593.23→285.09；香叶木素-7-O-Β-D-葡萄糖苷m/z 463.12→301.02。 结果： 采用超高效液相串联三重四级杆质谱法，同时运用多离子反应监测模式（MRM）检测铜丝藤根水煎液中对香豆酸、金合欢素、芹菜素、蒙花苷和香叶木素-7-O-Β-D-葡萄糖苷，并进行方法学验证。5种成分在浓度范围内均显示良好的线性 ( r>0.99)，最低定量限的范围为0.1和0.2 ng·mL-1。方法精密度（RSD）的范围为4.1%-9.2%，提取回收率的范围为88.89%-108.15%；各成分基质效应结果是88.73%, 94.19%, 96.51%, 87.66% 和99.66%，基质对检测不造成影响；5种成分高、中、低浓度的短期，长期及反复冻融稳定性 RSD 均小于 10.0%，表明样品中5种化合物在24h内，在-80℃条件及反复冻融情况下都有较好的稳定性。结论：本研究建立的超高效液相串联质谱法具有操作简便、快捷，灵敏度高等特点，能够快速有效地对铜丝藤根水煎液中对香豆酸、金合欢素、芹菜素、蒙花苷和香叶木素-7-O-Β-D-葡萄糖苷5种活性成分含量进行测定。 目的： 建立咪达唑仑体外孵育体系并摸索其具体孵育条件，并在此体系下研究铜丝藤根中5种有效成分对香豆酸、金合欢素、芹菜素、蒙花苷和香叶木素-7-O-Β-D-葡萄糖苷分别对咪达唑仑在大鼠体外代谢的影响。进一步研究铜丝藤根中5种有效成分对咪达唑仑在大鼠体内代谢的影响。 方法： 1）以ACQUITY UPLC BEH C18柱(50mm×2.1 mm, 1.7μm) 色谱柱；流动相为乙腈-0.1%甲酸水，梯度洗脱，使用正离子多离子反应监测（MRM）扫描的UPLC-MS/MS方法测定底物咪达唑仑及其代谢物羟基咪达唑仑的浓度。 2）经摸索确立大鼠肝微粒体代谢咪达唑仑的体外孵育体系的条件，在 200μL 的体外孵育体系中分别包括5-10pmol大鼠微粒体，1-100μM 的咪达唑仑溶液以及100mM Tris-HCl缓冲液（PH=7.4），37℃水浴中预孵育5min，加入1mM 的NADPH启动反应进行，孵育时间为30min。样品经乙腈沉淀蛋白处理，用上述UPLC-MS/MS方法同时测定咪达唑仑和代谢产物羟基咪达唑仑的浓度，计算相应的酶动力学参数并作图。 3）在上述200μL体外孵育体系中分别加入浓度梯度为1~100 mM的对香豆酸、金合欢素、芹菜素、蒙花苷和香叶木素-7-O-Β-D-葡萄糖苷，于37℃ 水浴中孵育30 min。终止反应后，样品经处理，用UPLC-MS/MS法测定咪达唑仑和代谢产物羟基咪达唑仑，并计算其在各个不同微粒体孵育体系中的IC50值。 4） 18 只 SD 雄性大鼠随机分成三组，对照组和实验组，禁食 12h 后，对照组给予10mg/kg单剂量咪达唑仑；实验组分别给予5mg/Kg芹菜素和金合欢素后，与对照组保持一致给予10mg/kg单剂量咪达唑仑。灌胃后在时间点：0.083，0.25，0.5， 1，1.5，2，3，4，和6h，采取血样，离心取血浆于-80℃保存。通过UPLC-MS/MS法检测大鼠血浆中咪达唑仑和代谢产物羟基咪达唑仑的血药浓度，应用软件DAS进行药动学分析及SPSS17.0进行统计学分析。 结果： 1）建立了灵敏可靠的检测血浆中咪达唑仑及其代谢产物羟基咪达唑仑的UPLC-MS/MS方法。血浆中两种成分在浓度范围内均显示良好的线性( r>0.99)，羟基咪达唑仑和咪达唑仑最低定量限为 0.1 和 0.5 ng·mL-1。方法日内精密度（RSD）的范围为1.2%-6.3%，日间精密度在1.9%-6.8%的范围内；提取回收率均大于 73.1%；基质效应在 92%-107.6%之间，基质对检测不造成影响；样品稳定性良好。 2）在确立的大鼠肝微粒体代谢咪达唑仑的体外孵育体系中芹菜素和金合欢素在1~100μM的浓度范围对咪达唑仑表现出不同程度的抑制作用。在体外大鼠肝微粒体体系中，芹菜素的IC50为58.46μM，金合欢素的IC50为8.20μM。 3）芹菜素和金合欢素在大鼠体内都能不同程度的抑制咪达唑仑代谢。金合欢素和咪达唑仑合用后，咪达唑仑的Tmax增加130%，Vz/F降低43%倍，羟基咪达唑仑的AUC降低34%，CLz/F增加62%，Cmax降低20%；芹菜素和咪达唑仑合用后，咪达唑仑的AUC增加55%，Tmax 增加217%倍，Vz/F降低42%，CLz/F下降39%，Cmax增加153%，羟基咪达唑仑的AUC降低41%，CLz/F增加116%， Vz/F 降低43%，CLz/F增加76%，Cmax降低40%。 结论： 通过大鼠体内外实验结果分析，芹菜素和金合欢素在一定浓度范围内会影响咪达唑仑的药代动力学过程。因此在两者合用时，应该注意咪达唑仑的用药剂量。同时，这些数据结果也为服用咪达唑仑的患者在合理饮食方面提供相关的科学依据。