论文部分内容阅读
目的:以MPTP构建PD小鼠模型,MPP+构建PD细胞模型,探讨虫草素(Cor)对PD模型多巴胺能神经元的保护作用,并从MAPK信号通路、Nrf2信号通路以及PI3K/Akt信号通路来探讨其可能的作用机制。方法:1.体内实验:将C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组(30mg/kg MPTP)和虫草素组(2.5、5.0、10.0mg/kg Cor)。采用旷场、转棒和爬杆实验检测小鼠的运动能力。应用HPLC-ECD法测定纹状体内多巴胺(DA)、二羟苯乙酸(DOPAC)以及高香草酸(HVA)的含量。免疫组织化学法检测黑质致密部TH免疫阳性细胞数。TUNEL法检测黑质区凋亡细胞数。分光光度法测定MDA含量以及SOD和GSH-Px活性。Western blotting法检测黑质区Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2、p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK1/2 和 p-JNK1/2 蛋白的表达。2.体外实验:将PCI2细胞分为对照组、模型组(500μMMPP+)和虫草素组(0.5×10-6、2.0×10-6、8.0×10-6μMCor)。MTT法测定细胞存活率,Hoechst33258核染色检测细胞凋亡,流式细胞仪分析细胞凋亡率。DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS含量。Western blotting法测定细胞内 Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2、p53、HO-1、Akt、p-Akt 蛋白的表达,以及胞浆和胞核Nrf2的蛋白表达。为进一步探究PI3K/Akt信号通路和Nrf2信号通路的关系,在加入PI3K抑制剂(LY294002)后,同上法测定细胞存活率、ROS含量以及HO-1、Akt、p-Akt、胞浆和胞核Nrf2蛋白的表达。结果:1.Cor对MPTP-PD小鼠DA能神经元凋亡的保护作用及对MAPK信号通路的影响(1)Cor对PD小鼠DA能神经元的保护作用:Cor能显著提高PD小鼠的自发活动能力、肌张力以及身体协调性,提高纹状体内DA、DOPAC和HVA含量,减少PD小鼠黑质致密部TH免疫阳性神经元的丢失。(2)Cor抑制PD小鼠DA能神经元凋亡:Cor能够明显减少PD小鼠黑质区凋亡细胞数,并且能明显下调黑质区促凋亡蛋白Bax和Cleaved Caspase-3的表达,显著增加抗凋亡蛋白 Bcl-2的表达并提高Bcl-2/Bax的比值。(3)Cor提高PD小鼠黑质区抗氧化能力:Cor能够减少PD小鼠黑质MDA的产生,并提高抗氧化酶SOD和GSH-Px活性。(4)Cor抑制MAPK信号通路的激活:不同剂量Cor均能下调PD小鼠黑质区p-p38、p-ERK1/2和p-JNK1/2蛋白的表达,而各组p38、ERK1/2和JNK1/2蛋白表达无明显差异。2.Cor通过激活PI3K/Akt-Nrf2通路抑制MPP+诱导的PC12细胞氧化应激损伤(1)Cor抑制MPP+诱导的PC12细胞凋亡:Cor能改善PD模型细胞形态,使出现细胞核凝聚和碎裂等凋亡特征的细胞明显减少,降低总凋亡率。并能显著抑制Bax、p53以及Cleaved Caspase-3的表达,上调Bcl-2表达,并提高Bcl-2/Bax比值。(2)Cor对氧化应激相关的Nrf2通路以及PI3K/Akt通路的影响:Cor能显著提高PD细胞存活率,并能减少细胞内ROS的积聚。Cor能激活Nrf2通路,促进Nrf2从细胞浆进入到细胞核,并能使Nrf2诱导的HO-1蛋白水平显著增加,同时还能使Akt磷酸化水平明显升高,激活PI3K/Akt信号通路。(3)Cor激活Nrf2通路依赖于PI3K/Akt通路的激活:加入PI3K抑制剂(LY294002)后,Cor对MPP+诱导的细胞损伤的保护作用以及抑制细胞内ROS枳聚的作用被明显减弱。并且LY294002可显著抑制Cor诱导的p-Akt、HO-1蛋白表达的上调以及Nrf2的核转位。结论:Cor对MPTP/MPP+诱导的PD模型具有神经保护作用,其作用机制可能与激活PI3K/Akt-Nrf2 信号通路和抑制MAPK信号通路的激活,来减少氧化应激损伤,从而抑制DA能神经元凋亡有关。