疫苗是当今控制包括人和动物各种传染病的有效方法,寻找制备疫苗的有效技术方法一直是生命科学,包括农业基础科学(如农业生物技术)应用研究的一个热点问题。越来越多的研究结果表明,人类多种疾病的致病病原体都来自动物宿主,当今严重危胁人类的艾滋病的病原体艾滋病毒就来自人类的近亲非洲绿猴,近几年全球关注的SARS和禽流感使人类更加深刻认识到了人与动物之间的密切关系。因此,人类发明用于防治传染病的疫苗制备技术也可以用来制备动物疫苗,不但可以防治动物疾病,同时也可以避免动物(特别是人类的宠物)将疾病传播给人类。随着人类对疫苗机理的深入认识,甚至已经将制备疫苗的技术和理念应用于制备防治肿瘤、变态反应等严重危害人类生命和身体健康的疾病。总之人类获得的制备疫苗策略不但可以防治人类疾病,也可应用于农牧业动物疾病的防治。因此,寻找制备疫苗的有效技术方法一直是生命科学包括农业科学研究的热点领域,可以解决人类疾病有效防治手段的同时,也可以解决农业动物疾病和人畜共患病的防治问题。以往的疫苗研究或现有的疫苗佐剂大都含有细菌抗原成份,比如结核杆菌就是福氏完全佐剂的常规成份。最早人们利用霍乱毒素β亚基和自身抗原分子结合作为疫苗,诱导免疫系统产生抗自身分子的免疫反应。细菌表面抗原43(Ag43)是大肠杆菌表达于细菌表面的一个抗原分子,具有强大的免疫原性。生物信息学分析表明,Ag43中含有大量的T和B淋巴细胞表位,是一个免疫原性极强的抗原分子,类似霍乱毒素p亚基,可以用于打破免疫耐受。但是Ag43还具有不同于霍乱毒素p亚基的特性,Ag43是大肠杆菌表达的一种表面抗原蛋白分子,该蛋白是自转运家族的一个成员,本身就具有了向细菌表面转运的所有信息成份,具备了向细菌表面表达的能力,不依靠任何其它分子(比如伴侣分子)的帮助。此外,Ag43只要加热至60℃即可从细菌表面分离。因此,本研究设想利用Ag43能自身向细菌表面展示表达的特点,通过基因工程技术构建一个Ag43的表达质粒,该质粒同时能够将外原自身抗原分子代替Ag43α段的一部分,构成一个Ag43的嵌合分子,这样和Ag43嵌合的外来抗原分子就能和Ag43一起通过细菌的内外膜,最终展示表达于细菌表面,通过加热方法提取该蛋白,这样就达到方便、快捷和高效提取重组蛋白的目的,为将来应用制备重组蛋白疫苗提供了极大的便利。本研究首先利用基因敲除技术(TargeTron Gene Knockout System)敲除含有Ag43基因的大肠杆菌JM109(敲除后命名为Tan109),使基因敲除后的细菌Tan109不能表达Ag43分子,这样就可以作为宿主菌表达基因工程重组质粒所携带的基因。本研究还利用基因工程技术将大肠杆菌Ag43基因(含有完整的信号肽和β段以及大部分5’端a段)插入原核表达质粒pET-22b中,获得一个新的重组质粒pETAg43。将Ag43基因敲除细胞Tan109和重组质粒pETAg43作为一个基因工程表达系统,发现将重组质粒PETAg43转进细菌Tan109并用IPTG诱导后,Tan109可以高效表达Ag43的基因产物,说明由细菌Tan109和质粒pETAg43是一个有效的基因表达系统。本研究将这一个表达系统称为"Ag43细菌表面展示系统”。本研究的主要设想是利用Ag43分子能够向细菌表面展示的能力将外源抗原分子作为Ag43分子的一部分(二者嵌合在一起),将外源抗原和Ag43一起表达于细菌表面,这样就极容易提取得到二者的嵌合分子蛋白作为疫苗。为了证明Ag43细菌表面展示系统是否能够有效地将外源分子展示于细菌表面,本研究用绿色荧光蛋白(GFP)基因作为标记基因,借助GFP发出荧光信号,研究加热法提取Ag43细菌表面展示系统表达外源基因蛋白产物的最佳条件。利用PCR技术从含有绿色荧光蛋白基因的重组质粒pEGFP-Cl中克隆扩增出GFP基因,然后利用基因工程技术将该基因连接到Ag43细菌表面展示系统的pETAg43质粒中,获得了一个含有GFP基因的重组质粒pETAg43-GFP。 pETAg43-GFP经使用内切酶酶切和基因测序分析正确后转入Ag43细菌表面展示系统的表达菌Tan109,用IPTG进行诱导表达。用荧光显微镜观察发现,诱导后的细菌有明显的绿色荧光信号,而没有转染pETAg43-GFP的细菌Tan109的绿色荧光不明显。将表达绿色荧光的细菌加热到60℃后发现大部分绿色信号消失。这些结果说明,质粒pETAg43-GFP可以在细菌表面展示系统的表达菌Tan109中有效表达,表达的GFP荧光蛋白可以展示于细菌表面。将GFP细菌表面展示表达的细菌在不同加热温度和加热时间里观察细菌表面荧光信号并提取细菌上清进行电泳分析,发现提取Ag43和GFP(代表外源基因)嵌合蛋白的最佳温度条件为55℃,最佳加热时间为40-60分钟。GFP只是一个报告蛋白,为了验证本研究获得Ag43细菌表面展示系统是否能够有效制备Ag43嵌合重组蛋白作为疫苗,本研究将人类的肿瘤抗原作为制备疫苗的研究对象。肿瘤抗原不同于病原体抗原,人和动物的病原体抗原一般都能诱导免疫系统产生免疫应答,但是肿瘤抗原是自身抗原,由于免疫系统对自身抗原有免疫耐受的现象,一般不会对自身抗原产生免疫应答,如果要诱导产生肿瘤免疫应答就要设法打破这种免疫耐受。为此,本研究选择肿瘤血管生成相关的抗原分子endoglin作为模式抗原分子,用Ag43细菌表面展示系统将endoglin进行细菌表面展示表达,了解是否能作为肿瘤疫苗。为将Ag43细菌表面展示系统制备人类和农业动物疫苗奠定基础。本研究利用基因工程技术将endoglin基因插入Ag43细菌表面展示系统的表达质粒pETAg43中,获得表达endoglin的重组质粒pETAg43-END。同样用内切酶进行酶切和测序鉴定证明质粒pETAg43-END构建正确后转入Ag43细菌表面展示系统表达菌Tan109,用IPTG进行诱导表达。诱导表达后用抗endoglin的单克隆抗体作为一抗和FITC标记的二抗进行检测,在荧光显微镜下观察荧光变化证明PETAg43-END有效表达后,参照GFP研究所获得的最佳加热提取温度和时间对Ag43/END嵌合蛋白进行分离提取。本研究将Ag43/END作为蛋白疫苗,在三个实体肿瘤(CT26, Meth A andLL/2)和一个转移瘤(B16)模型中分别观察保护和治疗肿瘤的作用。观察结果表明,Ag43/END作为疫苗免疫小鼠的肿瘤体积均比其它三个对照组小,且生存时间明显长于三个对照组,统计学处理表明Ag43/END作为疫苗免疫的小鼠和其它小鼠之间有明显的统计学差异。在肿瘤转移模型中发现Ag43/END作为疫苗免疫小鼠肺表面肿瘤转移的数量明显少于对照组,肺重量明显轻于对照组。在CT26模型肿瘤模型的治疗组当中,发现一只荷瘤小鼠肿瘤最后完全消失,只留下疤痕。这些观察结果表明,Ag43/END作为疫苗具有明显的抗肿瘤作用。为了阐明Ag43/END作为疫苗诱导产生抗肿瘤作用的机理,本研究首先用Western Blot方法检测小鼠免疫后的血清中抗自身endoglin的抗体,发现Ag43/END疫苗组血清中有到抗endoglin的抗体,而三个对照组均为阴性。用带有FITC标记(可以发出绿色荧光)的兔抗小鼠IgG抗体直接检测肿瘤组织的自身抗体,发现只在Ag43/END疫苗免疫的小鼠肿瘤组织中有荧光表达,并且荧光信号展现的形态完全符合血管的形态特征,说明有自身抗体沉积于Ag43/END疫苗免疫的小鼠肿瘤组织的血管上。用ELISPOT技术直接检测小鼠脾脏分泌抗endoglin抗体的淋巴细胞,只有Ag43/END疫苗免疫的小鼠脾脏细胞中发现有分泌抗自身endoglin的B淋巴细胞,说明本研究制备获得的Ag43/END嵌合蛋白作为疫苗能够诱导免疫系统打破免疫耐受,产生抗自身endoglin的抗体。此外,本研究用免疫组织化学和海藻酸盐包裹肿瘤细胞体内试验观察肿瘤血管生成情况,发现Ag43/END疫苗免疫的小鼠肿瘤血管生成明显减少,和对照组比较有明显的统计学差异。说明利用Ag43细菌表面展示系统制备的Ag43/END嵌合蛋白疫苗抗肿瘤作用的主要机理是通过诱导免疫系统产生抗自身的免疫反应,产生了抗自身endoglin的抗体,并且通过这些抗体阻断了endoglin的信号通路,进而抑制肿瘤血管生成,最终达到治疗肿瘤的作用。综上所述,本研究成功构建了一个可以将外源基因和Ag43嵌合表达并能够将表达的嵌合蛋白表达展示于细菌表面的原核表达系统,将其称为“Ag43细菌表面展示系统”。Ag43细菌表面展示系统展示表达的嵌合蛋白只要加热50℃就可以有效提取获得纯一的嵌合蛋白。Ag43细菌表面展示系统展示表达的Ag43和endoglin的嵌合蛋白(Ag43/END)作为蛋白疫苗,具有明显的抗瘤作用。机理研究表明,Ag43/END作为疫苗可以诱导免疫系统打破endoglin的免疫耐受,产生抗自身endoglin的抗体。通过抗endoglin的自身抗体抑制endolgin相关的肿瘤血管生成,达到治疗肿瘤的目的。说明Ag43细菌表面展示系统是一个有效制备Ag43嵌蛋白疫苗的工具,嵌合于重组蛋白中Ag43是一个良好的疫苗佐剂分子,通过Ag43可以诱导产生良好的免疫应答反应。因此,该系统目前不但有可能应用于制备并应用于家畜、家禽和宠物的肿瘤防治疫苗,而且有可能应用于人类肿瘤防治疫苗的制备,展现出了可喜的应用前景,