内皮抑素(endostatin)是一种内源性血管生成抑制剂，由OReilly等人于1997年发现，具有抗肿瘤血管生成作用。在这篇论文中，为了获得内皮抑素蛋白，作者尝试了多种表达系统。 第一，尝试在大肠杆菌中表达可溶性的内皮抑素蛋白，构建了pET-28a—endostatin质粒。为了研究内皮抑素在大肠杆菌中可溶性表达的条件，在小量表达的情况下，考察了温度、分子伴侣、金属离子和还原剂对内皮抑素可溶性表达的影响。实验发现，降低表达的温度，可以提高可溶性目的蛋白在总目的蛋白中的比例。当表达温度从37℃降到28℃时，可以使可溶性endostatin蛋白占总目的蛋白的比例提高到10％。使用分子伴侣共表达，帮助蛋白质正确折叠，也能够起到明显的效果。28℃时，与分子伴侣pG—Tf2共转化表达时，可溶性的endostatin蛋白占总目的蛋白量的38％；与分子伴侣pG—KJE8共转化表达时，可溶性目的蛋白占总目的蛋白的65％。而锌离子对表达几乎没有影响。巯基乙醇虽然可以使可溶性的endostmin蛋白占总endostatin蛋白的25％，但总目的蛋白表达量大幅度下降，是未加巯基乙醇时总目的蛋白表达量的1/3。综合以上结果，在大量表达时，我们选择了低温、分子伴侣共表达的条件。 第二，在大肠杆菌表达系统中，尝试通过包涵体变复性的方法，获得内皮抑素及其变体蛋白，构建了pET-23a—endostatin和pET-23a—endostmin-linker—RGD质粒。复性效率约50％，1 L LB培养基可以获得约15 mg目的蛋白。通过鸡胚尿囊膜实验测定了复性的endostatin和endostatin-RGD蛋白的抗血管生成活性并对它们进行了比较。初步结果显示在μg级的剂量下，endostatin和endostmin-RGD对新生血管生成有着显著的抑制作用。而且在相同剂量下，endostatin-RGD的抑制效果比endostatin更明显。证明RGD肽能够增强内皮抑素蛋白抑制鸡胚尿囊膜血管生成的活性。 第三，尝试通过酵母表达系统来获得分泌表达的内皮抑素蛋白，构建了质粒pPIC9K—endostatin，在GS115中表达。虽然目的蛋白的表达量没有在大肠杆菌表达系统中的高，1 L BMGY培养基只能获得0.6 mg目的蛋白，可是纯度比较高，纯化比较简单。 此外，初步尝试了将endostatin用于基因治疗的方法，构建了带有绿色荧光蛋白的重组pIRES—endostatin-EGFP和pIRES—endostatin-RGD—EGFP质粒，初步摸索了重组质粒转染不同细胞株的效率。应用实验室自行开发的新型转染试剂PEI，转染293细胞、B16F10细胞、A549细胞、LLC细胞后发现，转染效率波动比较大。当转染时间达到48小时，细胞状态都很差。还要改进转染方法，调整细胞状态，重复实验。为endostatin的基因治疗做准备。