一株新型分离菌株Bacillus sp.HBCD-sjtu对六溴环十二烷的降解机理研究

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工业化学品释放造成的环境污染是目前最重要的环境危害之一。六溴环十二烷(HBCD),一种非芳香族溴化阻燃剂,是一种有毒化合物,它由12个碳原子的脂环组成,其上连接有六个溴原子,是由顺式-反式-反式-1,5,9-环十二碳三烯的溴化反应形成的。但由于它是一种环境污染物,因此现在在一些国家被限制使用。六溴环十二烷(1,2,5,6,9,10-六溴环十二烷)是一种广泛分布的环境污染物。毒理学研究表明,六溴环十二烷可能诱发癌症并影响人体甲状腺激素。六溴环十二烷(HBCD)是一种添加溴化阻燃剂,由于在不同环境中的广泛使用和含量的增多而受到极大关注。六溴环十二烷(HBCD)的毒性会对生态系统和人类造成严重的风险。土壤-植物生态系统受这种严重污染物(六溴环十二烷)的毒性作用的影响很大。但是,据报道,关于六溴环十二烷降解的信息很少。去除这种污染物的一种有效方法是使用细菌进行生物降解。首先,从中国上海的垃圾填埋场采集的废水样品中使用浓缩培养技术分离出一株名为Bacillus sp.HBCD-sjtu的菌株。基于形态学,生物化学和系统发育分析,该菌株被归类为蜡状芽孢杆菌并命名为菌株HBCD-sjtu。当该菌株在含有0.5mM HBCD的无机盐培养基,在30℃,pH 7.0和200RPM条件下生长时,观察到最大生长和HBCD降解活性。在Pacific Biosciences(PacBio)RS II测序仪(Pacific Biosciences,USA)上对仅由一个环状染色体组成的菌株HBCD-sjtu的基因组进行测序。编码区包含4,414,071bp和5,360个开放阅读框。基因组编码的总rRNA占总基因组的1.7%。整个基因组包含10个负责芳香化合物降解的基因和80个与运动和趋化性相关的基因。编码11种脱卤素酶的基因也在菌株HBCD-sjtu全基因组序列中注释。负责氧化酶,CAZy基因(碳水化合物活性酶),聚集规则间隔短回文重复基因(CRISPRs),综合抗生素抗性基因的其他许多重要的基因也在菌株Bacillus sp.HBCD-sjtu的全基因组序列中注释。这个全基因组序列对于阐明六溴环十二烷降解的分子机制有着至关重要的作用。其次,使用MEGA 4.1通过邻接(NJ)方法进行菌株Bacillus sp.HBCD-sjtu的表征,并构建系统发育树。进行了生理和生化特征的确定,例如不同碳源的使用和酶性质测定。芽Bacillus sp.HBCD-sjtu最适生长条件为30℃,pH7.0和200转/分钟,同时检测到1.5mM的HBCD最大耐受能力。菌株HBCD-sjtu的HBCD降解在不同的培养温度、pH值、六溴环十二烷浓度和转速下进行了优化。在这些优化的条件下检测降解速率,细胞生长情况和HBCD转化情况。在不同NaCl浓度下检测菌株HBCD-sjtu的耐盐活性。在0.5%NaCl下检测到菌株HBCD-sjtu的最大生长速率。盐浓度的增加大大降低了菌株的生长速率。基于气相色谱-质谱分析,鉴别出四种不同的代谢中间体,1,5,9-环十二碳三烯(CDT),1,5-环十二碳二烯(CDD),环十二碳烯和3,9-十二碳二烯。使用静息细胞反应,通过菌株HBCD-sjtu降解代谢物CDT。与HBCD代谢物相比,从CDT降解中鉴定出相同的代谢物。这些结果为六溴环十二烷的细菌降解和环境友好的六溴环十二烷生物降解方法提供了创新性理解。第三,通过来自菌株Sphingobium indicum B90A的LinB酶(一种HBCD降解酶)与DehHZ1酶的序列进行同源建模,从菌株HBCD-sjtu中鉴定出六溴环十二烷降解基因dehHZ1。同时获得了酶DehHZ1的三维(3D)模型结构。使用活性位点获得DehHZ1酶与化合物HBCD的结构和功能的关系。在含有0.1mM HBCD的无机盐培养基(MSM)的30℃,pH7.0和200RPM培养条件下观察到含有基因dehHZ1的转化体的HBCD降解能力。基于HBCD降解后的气相色谱-质谱分析,鉴别出中间体1,5,9-环十二碳三烯(CDT)。这些发现可能为六溴环十二烷降解及其转化为新代谢物的环境友好型途径提供新的见解。最后,分析了菌株Bacillus sp.HBCD-sjtu在不同六溴环十二烷胁迫条件下(0,0.2,0.4和0.6 mM六溴环十二烷)对小麦土壤中六溴环十二烷的降解和小麦形态生理特性的影响。用菌株HBCD-sjtu接种过的小麦植物与未接种的植物相比,其生长性状如枝条高度,根长,枝条鲜重,枝干重,叶数,叶面积和叶总叶绿素含量得到显著改善。由于六溴环十二烷的胁迫,在接种HBCD-sjtu菌株的植株中发现叶片丙二醛(MDA),过氧化氢(H2O2),游离脯氨酸和总可溶性糖(TSS)水平升高。在气相色谱-质谱分析的基础上鉴定了在HBCD降解后新的中间体1,5,9-环十二碳三烯(CDT)的形成。还应用可获得的标准化方案分析了菌株HBCD-sjtu的磷酸盐溶解化和固氮活性。最后研究了菌株HBCD-sjtu的吲哚乙酸(IAA)生产潜力,研究显示出IAA的大量生产。结果表明,通过在六溴环十二烷和非六溴环十二烷条件下接种菌株HBCD-sjtu可以改善小麦的生长。这项研究可能会扩展到其他植物的促生长,并找出新的环境友好的六溴环十二烷降解及转化为其他代谢物的方法。
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