研究背景：宫腔粘连(intrauterine adhesions, IUA)又称Asherman综合征,由Asherman于1948年首先详细描述报道并定义为：由于子宫内膜损伤导致子宫内膜纤维化,宫腔部分或全部闭锁,继而引起月经过少、闭经、不孕或反复流产。临床上常表现为月经量减少、继发性闭经或周期性腹痛,可引起前置胎盘、胎盘粘连或植入等产科并发症,甚至导致反复流产或不孕,严重影响育龄期女性患者的身心健康及生育能力。随着人流术等宫腔操作的增加、宫腔镜手术在妇科领域的普及以及临床医生对宫腔粘连认识的提高,宫腔粘连的发病率和诊断率日益增高,但其治愈率和妊娠率仍较低。宫腔粘连的治疗需要综合性、个体化的治疗,前提是分离粘连,关键在于预防粘连再发,重点是促进子宫内膜修复。目前公认采用宫腔镜下粘连分离术、节育器隔离及术后加用大剂量雌激素的综合方法进行治疗,但术后再粘连发生率仍较高,尤其重度粘连者,术后再粘连发生率高达62%。因此,探索宫腔粘连的发病机制,寻求有效作用靶点来阻断子宫内膜纤维化的发生、预防宫腔粘连的形成,成为临床医生及科研学者的共同目标。宫腔粘连是子宫内膜损伤后异常修复、纤维化形成的结果。与其他脏器纤维化过程相似,宫腔粘连的形成同样存在着纤维化病变的共同病理基础——细胞外基质(extracellular matrix, ECM)过度堆积,组织重构,瘢痕形成。子宫内膜基底层损伤后出现胶原纤维过度增生、细胞外基质沉积,而子宫内膜增生受抑制,内膜组织逐渐被纤维结缔组织取代,导致内膜纤维化,进而瘢痕形成,出现粘连。因此,阻断子宫内膜损伤后修复过程中的纤维化和细胞外基质形成,可能对预防宫腔粘连的发生起着积极作用。转化生长因子-β1(transforming growth factor-beta, TGF-β1)是迄今发现最主要的促纤维形成细胞因子,其信号主要经下游中介分子Smad2、Smad3进行转导。创伤发生后,TGF-β1首先由血小板释放至损伤部位,剂量依赖性地趋化成纤维细胞、单核细胞、中性粒细胞等细胞。TGF-β1与成纤维细胞等细胞膜上的特异性受体结合后,由Smad2、3将TGF-β1信号经胞质传导至胞核内,进而调节基质蛋白(包括纤维粘连蛋白和胶原蛋白)等靶基因的转录,并调控ECM的合成和降解。正常生理条件下,TGF-β1可以促进损伤部位的组织修复和伤口愈合,此时ECM的合成与降解处于动态平衡状态；而病理条件下,TGF-β1可刺激纤维粘连蛋白、胶原蛋白等基质蛋白的基因转录,加速ECM的合成并抑制ECM的降解,形成纤维粘连。microRNA-29(简称miR-29)是新近发现的一个与纤维化疾病紧密相关的小分子RNA家族,已成为生物学研究的新热点。miR-29在多种脏器纤维化组织部位的表达均下降,如心梗部位的心肌组织、肝星状细胞、肺纤维化组织等,且下降程度与纤维化程度呈正比。miR-29不仅可直接抑制多种ECM成分的表达,还参与了包括TGF-β1/Smad信号通路等多条与纤维化相关的信号通路。TGF-β1可抑制miR-29的表达,而过表达miR-29可反过来降低TGF-p1的表达,并抑制Smad3活性。由此可见miR-29具有强大的抗纤维化潜能,为纤维化疾病的诊断和治疗提供了新的思路。目前miR-29在宫腔粘连子宫内膜中的表达情况未见相关报道。现已知人类miR-29包括miR-29a, miR-29b1, miR-29b2和miR-29c,其中miR-29a的靶基因具有最多的细胞纤维化相关蛋白,故本课题选择miR-29a作为目标因子进行研究。如果能明确miR-29a在子宫内膜中的表达,确定其与宫腔粘连之间的关系,及其在子宫内膜纤维化病变过程中的作用潜能,有望为防治宫腔粘连提供新的研究方向。因此,本课题从纤维化形成的相关细胞因子着手,拟采用荧光定量PCR法(fluorescence quantitative polymerase chain reaction, FQ-PCR)和免疫组化法(immunohistochemistry, IHC)检测宫腔粘连患者子宫内膜组织中TGF-β1、Smad2、3及miR-29a等因子的表达情况,探讨其与宫腔粘连的相关性,为后续深入研究提供理论依据,寻求可能的作用靶点来阻断和预防宫腔粘连的形成和发展。研究资料：1分组：收集2012年3月至2014年01月在我院行宫腔镜手术的IUA患者共80例,依宫腔粘连程度将其分为轻度粘连组、中度粘连组、重度粘连组3个组,其中轻度粘连组30例,中度粘连组26例,重度粘连组24例。选取同期非IUA患者共27例为对照组。各组年龄、孕产次、宫腔手术操作次数等一般性资料经统计学分析比较差异无显著性(P>0.05),具备可比性。为了避免不同月经周期体内性激素水平变化对检测结果的影响,各组病例均为术后病理证实子宫内膜处于增生期的患者。本研究已经单位伦理委员会批准通过,并取得患者知情同意。2宫腔粘连分级标准：①轻度粘连：累及宫腔<1/4,粘连菲薄或纤细,输卵管开口和宫腔上段病变很轻或清晰可见；②中度粘连：累及1/4-3/4宫腔,仅粘连形成,无宫壁粘着,输卵管开口和宫腔上段部分闭锁；③重度粘连：累及宫腔>3/4,宫壁粘着或粘连带肥厚,输卵管开口和宫腔上段闭锁。3排除标准：①有糖尿病、甲状腺功能亢进等内分泌疾病史；②患有肝硬化、肺纤维化、系统性硬化等与纤维化可能相关的疾患；③卵巢性、垂体性或下丘脑性闭经所致闭经者；④宫腔镜手术证实合并有其他子宫内疾病者(如子宫内膜息肉、子宫肌瘤)；⑤术后子宫内膜组织HE染色证实为分泌期子宫内膜者。第一章TGF-β1、Smad2、3在宫腔粘连患者子宫内膜组织中的表达及意义目的：检测TGF-p1和Smad2、3在宫腔粘连患者子宫内膜组织中的mRNA及蛋白表达水平,明确TGF-p1和Smad2、3在子宫内膜组织中的表达情况,探讨其在宫腔粘连发生中的意义,为后续实验提供依据。方法：1FQ-PCR法测定子宫内膜组织中TGF-β1、Smad2、3的mRNA相对表达量于宫腔镜手术中留取新鲜子宫内膜组织,依次用RNA提取试剂盒提取子宫内膜总RNA,逆转录试剂盒合成cDNA。逆转录反应条件为：37℃15min,85℃5sec,4℃冰浴。荧光定量PCR反应条件为：95℃30s预变性；95℃5s→60℃34s,重复40个循环进行扩增反应；95℃15s→60℃1min→95℃15s,制备融解曲线。每一样品设3个复孔,反应终止由计算机得出各反应管的初始循环数CT值(Threshold Cycle, CT)。以p-actin作为内参基因,采用相对定量法2-ΔΔCT计算TGF-β1、Smad2、Smad3mRNA的相对表达量。2IHC法测定子宫内膜组织中TGF-β1、Smad2、3的蛋白表达留取子宫内膜组织,4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋方法制作石蜡标本并切片,切片厚度为4μm。组织切片常规脱蜡水化后,HE染色,显微镜下观察,选取处于增生期子宫内膜的病例进行后续实验。石蜡切片脱蜡水化,pH6.0柠檬酸钠微波加热进行抗原修复,3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性,山羊血清封闭非特异性抗原,TGF-β1、Smad2/3一抗(工作浓度为1：100)4℃孵育过夜,同时用PBS代替一抗进行阴性对照,次日孵育二抗,DAB显色,显微镜下观察,拍照留图。用图像分析系统自动检测每张图片的累积光密度值(integrated optical density, IOD,计算5个视野图片的IOD平均值。结果：1TGF-β1、Smad2、Smad3在子宫内膜组织中的mRNA相对表达量1.1TGF-β1、mRNA相对表达量TGF-β1、mRNA相对表达量随宫腔粘连程度加重呈现递增趋势(对照组0.61±0.58、轻度粘连组0.84±0.53、中度粘连组1.11±0.54、重度粘连组1.66±1.62)。对照组与轻度粘连组相比无显著性差异(P=-0.343),轻度粘连组与中度粘连组相比差异亦无统计学意义(P=0.261)；对照组与中度粘连组相比差异有统计学意义(P=-0.046)；对照组及轻度、中度粘连组分别与重度粘连组相比,差异亦均有统计学意义(P<0.001、P=0.001、P=0.035)。1.2Smad2mRNA相对表达量从对照组、轻度粘连组、中度粘连组至重度粘连组,Smad2mRNA相对表达量依次递增(分别为0.63±0.45、0.84±0.43、1.05±0.52、1.41±0.76)。对照组与轻度粘连组相比无显著性差异(P=0.144),轻度粘连组与中度粘连组相比差异亦无统计学意义(P=0.155)；对照组与中度粘连组相比差异有统计学意义(P=0.006)；对照组及轻度、中度粘连组分别与重度粘连组相比,差异亦均有统计学意义(P<0.001、P<0.001、P=0.024)。1.3Smad3mRNA相对表达量与Smad2mRNA表达情况相似,Smad3mRNA在各组子宫内膜组织中的相对表达量逐渐升高(分别为0.57±0.49、0.95±0.51、1.19±0.47、1.34±0.59),差异有统计学意义(P<0.001)。各实验组与对照组相比,差异均有统计学意义(P轻度=0.006、P中度<0.001、P重度<0.001),轻度粘连组与重度粘连组相比差异亦有统计学意义(P=0.008)；中度粘连组与轻度、重度粘连组相比,差异无统计学意义(P=0.092,P=0.316)。2Smad2、3与TGF-β1、mRNA相对表达量的相关性分析对子宫内膜组织中Smad2、Smad3及TGF-p1的mRNA相对表达量进行相关性分析,结果显示rsSmad2=0.647, PSmad2<0.001;rsSmad3=0.663。提示Smad2、Smad3分别与TGF-β1呈显著正相关。3TGF-β1、Smad2、3在子宫内膜组织中的蛋白表达水平3.1子宫内膜中TGF-β1蛋白的表达TGF-β1位于胞浆中,在子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞中均可见阳性表达。TGF-β1蛋白水平由低到高分别为对照组.(均数134635.90)、轻度粘连组(均数266384.27)、中度粘连组(均数464274.10)、重度粘连组(均数719535.75)。对照组与各实验组比较,差异均有统计学意义(P轻度=0.001,P中度<0.001,P重度<0.001)；轻度粘连组与中度粘连组比较(P=0.002),轻度、中度粘连组与重度粘连组比较(P<0.001,P=0.004),差异亦均有显著性差异。3.2子宫内膜中Smad2、3蛋白的表达Smad2、3蛋白位于胞浆及胞核中,在子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞中均可见表达。其蛋白水平随宫腔粘连程度加重呈递增趋势(对照组均数78607.57,轻度粘连组均数113200.78,中度粘连组均数188062.00,重度粘连组均数472224.86)。对照组与轻度粘连组比较差异无统计学意义(P=0.160),与中度、重度粘连组比较差异均有统计学意义(P<0.001,P<0.001)；轻度粘连组与中度粘连组相比(P=0.040),轻度、中度粘连组分别与重度粘连组比较(P<0.001,P=0.005),差异亦均有统计学差异。4Smad2、3与TGF-β1蛋白IOD水平的相关性分析对子宫内膜组织中Smad2、3与TGF-β1的蛋白表达量IOD值进行Spearman相关性分析,结果显示rs=0.467,P<0.001。提示两者呈显著正相关。结论：1. TGF-β1、Smad2、3蛋白在子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞中均可见表达,但其在腺上皮及间质中的表达有无差异尚未可知,有待进一步研究探讨。2.子宫内膜组织中TGF-β1、mRNA及蛋白的过高表达可能在宫腔粘连的发病过程中起着重要作用。3.子宫内膜组织中Smad2、3mRNA及蛋白的过度表达可能参与了宫腔粘连的发生。4. TGF-β1/Smad2、3信号通路的正调控过度可能促进了宫腔粘连的形成。第二章miR-29a在宫腔粘连患者子宫内膜组织中的表达及意义目的：检测miR-29a在宫腔粘连患者子宫内膜组织中的相对表达量,明确其在子宫内膜组织中的表达情况,探讨其在宫腔粘连发生中的意义,为后续实验提供依据。方法：于宫腔镜手术中留取新鲜子宫内膜组织,依次用RNA提取试剂盒提取子宫内膜总RNA,逆转录试剂盒合成cDNA。逆转录反应条件为：42℃15min,85℃5sec,4℃冰浴。荧光定量PCR反应条件为：95℃30s预变性;95℃5s→60℃34s,重复40个循环进行扩增反应；95℃15s→60℃1min→95℃15s,制备融解曲线。每一样品设3个复孔。反应终止由计算机得出各反应管的CT值。以U6作为内参基因,采用相对定量法2-ΔΔCT计算检测miR-29a的相对表达量。结果：1miR-29a在子宫内膜组织中的相对表达量各组子宫内膜组织miR-29a的相对表达量由高到低分别为：对照组(1.62±0.55)、轻度粘连组(1.33±0.40)、中度粘连组(1.04±0.41)、重度粘连组(0.85±0.54)。对照组与各实验组比较,差异均有统计学意义(P轻度=0.024、P中度<0.001.P重度<0.001)；轻度粘连组分别与中度、重度粘连组相比亦有显著性差异(P=0.024,P<0.001)；中度粘连组与重度粘连组相比,差异无统计学意义(P=0.183)。2miR-29a与TGF-β1mRNA相对表达量的相关性分析对子宫内膜组织中miR-29a与TGF-p1的RNA相对表达量进行Spearman相关性分析,结果显示rsmiR-29a=-0.335,PmiR-29a<0.001。提示miR-29a与TGF-p1mRNA呈显著负相关。结论：1.子宫内膜组织中存在miR-29a,其水平与宫腔粘连病变程度紧密相关。2.子宫内膜组织中miR-29a的过低表达可能与宫腔粘连的形成有关。3.子宫内膜组织中miR-29a与TGF-β1mRNA关系密切,可能存在相互调节作用。全文小结1.TGF-p1及Smad2、3蛋白不仅表达于子宫内膜腺上皮细胞中,也表达于子宫内膜间质细胞中。2.宫腔粘连患者子宫内膜组织中TGF-β1Smad2.3的mRNA水平及蛋白水平均明显升高,且随宫腔粘连程度加重逐渐递增。推测宫腔粘连与TGF-β1/Smad2、3信号正调控过度相关,TGF-β1、Smad2、3表达增强可能促进了子宫内膜纤维化的发生。3.运用荧光定量PCR法可以高效地从极少量的子宫内膜组织中检测到miR-29a,证实了miR-29a在子宫内膜组织中的存在。4.宫腔粘连患者子宫内膜组织中miR-29a的水平显著降低,且随宫腔粘连程度加重逐渐减少。推测miR-29a表达过低可能与宫腔粘连的形成和发展有关,提示了miR-29a具有抗纤维化的作用。5.在宫腔粘连患者子宫内膜组织中,miR-29a水平降低,而TGF-β1的mRNA水平及蛋白水平均升高,且miR-29a与TGF-β1mRNA呈显著负相关,推测miR-29a与TGF-β1可能存在相互调节作用,共同参与了宫腔粘连的病变过程。