特应性皮炎(Atopic dermatitis,AD)是以炎性细胞浸润为主要表现的过敏性皮肤病。各种研究表明AD发病机制复杂,涉及遗传风险、环境暴露和免疫失调等多种因素,可激活多种免疫和炎症通路。近年来研究表明AD的免疫学发病机制与细胞因子的分泌异常相关。急性皮损临床上表现为强烈的瘙痒、红斑丘疹伴剥脱和浆液渗出。与正常皮肤相比,IL-4、IL-5和IL-13等TH2型细胞因子表达增多,但IFN-γ等TH1型细胞因子表达减少。慢性皮损由于慢性炎症而发生组织重塑,其特征是斑块增厚,斑纹增多(苔藓化),以及干燥的纤维化丘疹。慢性AD皮肤病变的Th2型细胞因子虽比正常皮肤显著增高,但较急性期相比表达明显减少,而Thl型细胞因子表达明显增多。不仅如此,在整个AD的发病过程中表皮中含有IgE的朗格汉斯细胞以及炎性树突状表皮细胞数量增加。嗜酸性粒细胞及肥大细胞的参与也有助于炎症反应及组胺的释放,从而引发和加重AD的发病。AD临床主要的一线药物包括皮质类固醇和钙调磷酸酶抑制剂。其他的治疗方法包括外用和口服抗生素,光疗和全身免疫抑制剂。但上述治疗手段往往存在多种不同的局限性,且对中重度AD患者疗效不理想。因此准确理解AD背后的机制对于开发更有效的治疗药物至关重要。其中,T细胞及T细胞来源的细胞因子是AD获得性免疫的主要驱动因素,靶向细胞因子的生物制剂已经彻底改变了免疫介导AD的治疗方法。尽管这些药物有效,但它们并未使所有患者完全缓解,促使开发替代策略--包括靶向细胞因子下游的细胞内信号转导途径成为AD治疗的新方向.JAK-STAT是最新研究发现的一条参与细胞因子细胞内信号传导的重要信号通路,对炎性细胞因子和不同生长因子的下游信号传导十分关键。JAKs成员有JAK1-3和Tyk2,而STATs成员有STAT1-6。AD的发病机制复杂,但部分原因是由JAK-STAT信号介导的免疫应答失衡。ILs及IFNs等细胞因子利用JAK-STAT通路将信号从细胞膜传导至细胞核,从而达到调节靶基因的目的。在本研究中,我们将JAK1/JAK2抑制剂Momelotinib(MMB)制备成外用型O/W型乳剂型软膏剂,考量其理化性质,并用其涂抹于DNCB诱导的AD小鼠模型背部皮损,观察其治疗效果。不仅如此,为了进一步明确MMB治疗AD的机制,我们还将MMB与胸腺机制淋巴生成素(Thymic stromal lymphopoietin,TSLP)诱导树突状细胞共培养,观察其对树突状细胞的影响。第一部分Momelotinib软膏的制备及其理化性质研究目的:制备MMB软膏并考察其理化性质。方法:筛选最优处方,将MMB原料药制作成O/W型乳剂型软膏剂,对MMB软膏进行外观性状的评估,观察其色泽、延展性、细腻度,并行粘度测试。在以上条件都满足药典要求后。建立MMB含量HPLC测量方法,并行专属性、精密度、回收率、48小时稳定性及40天温度实验,以考察MMB含量测定方法的可行性及MMB软膏在不同条件下稳定性。结果:MMBO/W水包油型软膏为淡黄色的半固体状制剂,外观细腻、均匀,易涂展。MMB软膏黏度测试结果显示平均值40Pa·S。当HPLC条件为:流动相为乙腈-水、检测柱温为40℃、流速为l.Oml/min、波长在254nm、进样量为10μ 1时,线性关系考察示MMB溶液浓度在100～130 μ g/ml范围内线性关系良好。专属性实验示MMB的保留时间为8min,空白乳膏基质在此处完全无吸收,对MMB的测定无干扰,各峰分离良好,峰形对称。精密度试验:浓度为40.0,70.0,100.0 μ g/ml的对照品溶液测定峰面积的RSD分别为1.65%、0.9%、0.8%(n=5)。回收率实验结果示MMB的平均回收率为99.7%,RSD为0.7%(n=5)。稳定性试验取浓度为20.0 μg/ml的对照品溶液,于室温下放置48 h并间断取样,计算MMB峰面积的RSD为1.392%,结果表明MMB溶液在48h内含量无衰减。样品的含量测定:分别制备0.1%,0.2%,0.5%的MMB软膏,测定其含量为0.11,0.21,0.50,符合药典规定。0.5%MMB软膏在4℃,25℃C,40℃条件下分别于0,10,20,30天测量其药物含量,其在4℃及25℃条件下RSD分别为1.392%,1.50%。而在40℃条件下,含量从10天起减少,至20天时,含量约为0天时含量的十分之一,至30天时,含量检测不出。结论:1.以本研究方法制备成的MMB O/W水包油型软膏为淡黄色的半固体状制剂,外观均匀、细腻,易涂展。2.当柱温为40℃C,流动相为乙腈-水、检测波长在254nm、流速为l.Oml/min、进样量为10 μ 1时,采用HPLC法测定MMB软膏的含量,方法简便可行。3.MMB软膏在4℃C及25℃C条件下,保存期可至少长达1个月。在40℃C条件下,含量不稳定。4.MMB软膏黏度测试结果显示,其粘稠度适当,符合中国药典(2010版)要求。第二部分Momelotinib软膏对AD小鼠模型的治疗作用及其机制目的:探讨 MMB 软膏对 2,4-二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorobenzene,DNCB)诱导AD小鼠模型的治疗作用及其机制。方法:将36只BALB/c小鼠随机分为正常组、0.1%MMB组、0.2%MMB组、0.5%MMB组、他克莫司组及模型组。除正常组外,其余各组均每周涂抹2次不同浓度DNCB直至28天诱导制作AD模型。模型组、0.1%MMB组、0.2%MMB组、0.5%MMB组、他克莫司组实验第15天开始,皮损处分别涂抹不含MMB的软膏基质、0.1%MMB软膏、0.2%MMB软膏、0.5%MMB软膏及他克莫司软膏,连续涂抹14天。于0、7、14、21、28天记录各组皮损严重程度评分;28天时记录各组小鼠体重;观察各组皮损处临床表现及组织病理形态,记录嗜酸性粒细胞及肥大细胞数;眼球取血,采用ELISA法检测血清IgE水平;取各组皮损组织,采用实时荧光定量PCR法检测IL-4、IL-5、IFN-丫、TSLP mRNA表达,Western Blot 法测量 STAT-1,STAT-3,STAT-5,p-STATl,P-STAT3,p-STAT5蛋白含量;流式细胞术检测小鼠脾脏淋巴细胞TH1/TH2/Treg分化。结果:实验28天时,模型组皮损处临床表现为红斑、点状出血、干燥及结痂,且皮肤厚度明显增厚,少量新生毛发,组织病理形态显示棘层增厚,颗粒层增生,真皮大量炎性细胞、嗜酸性粒细胞浸润。血清IgE水平明显升高。且皮损组织表皮厚度明显增厚,肥大细胞数明显增加,IL-4、IL-5、IFN-γ、TSLP mRNA表达显著上升(P均<0.05),符合特应性皮炎表现;各组小鼠实验28天时体重示,0.5%MMB组明显高于模型组,而他克莫司组明显低于模型组(P均<0.05);0.1%、0.2%、0.5%MMB均能降低特异性皮炎模型小鼠皮损严重程度评分,改善皮损处临床表现,组织病理形态,减少表皮厚度及肥大细胞数,并呈剂量依赖性,以0.5%MMB效果最佳。血清IgE的测量结果显示,0.1%、0.2%、0.5%MMB软膏均能降低AD小鼠的血清IgE水平,但无剂量依赖性,且他克莫司组血清IgE水平高于模型组;不仅如此,0.1%组皮损组织IL-4、IL-5、IFN-γ、TSLP mRNA表达较模型组相比下降(P均<0.05);0.2%MMB组皮损组织IL-4、IL-5、IFN-γmRNA相对表达量低于模型组及0.1%MMB组(P均<0.05);而0.5%MMB组皮损组织IL-4、IL-5、IFN-γ、TSLP mRNA相对表达量低于模型组、0.1%MMB组和 0.2%MMB 组(P 均<0.05);模型组皮损组织中 p-STATl、p-STAT3、p-STAT5蛋白表达明显升高,在0.5%MMB组中,p-STATl、p-STAT3、p-STAT5的表达受到明显抑制(P均<0.05);MMB软膏对AD小鼠脾脏CD4+细胞TH1/TH2比值及Treg占CD4+细胞比例无明显影响。结论:1.0.1%、0.2%、0.5%MMB软膏均能明显减轻AD小鼠临床症状及炎症程度评分。2.0.5%MMB软膏能明显减轻AD小鼠的体重减少。3.0.1%、0.2%、0.5%MMB软膏均能明显减轻AD小鼠血清IgE水平。4.0.1%、0.2%、0.5%MMB软膏均能明显减轻AD小鼠的组织病理学症状,减少表皮厚度及肥大细胞数量。5.0.1%、0.2%、0.5%MMB软膏均能明显减少AD小鼠皮损组织的炎性细胞因子数量。6.0.5%MMB软膏能明显抑制AD小鼠皮损组织中STAT1,STAT3,STAT5磷酸化。7.MMB软膏对小鼠脾脏CD4+细胞TH1/TH2/Treg动态分化无影响。第三部分Momelotinib对TSLP诱导树突状细胞的影响目的:探讨MMB对TSLP诱导树突状细胞的影响。方法:取雄性4～6周龄C57BL/6小鼠胫股骨骨髓离心后加入GM-CSF及IL-4进行体外培养,隔天半量换液并补足GM-CSF及IL-4,于1,3,5,7天时于显微镜下记录培养细胞成熟过程中形态学变化,培养至第7天,流式细胞术检测CD11C+细胞数达到80%后即确认培养细胞为BMDCs后,将BMDCs分为空白对照组,0 μ M MMB 组,0.1 μ M MMB 组,0.5 μ M MMB 组,1 μ M MMB 组,分别加入 Ong/ml TSLP+0 μ M MMB,150ng/ml TSLP+0 μM MMB,150ng/ml TSLP+0.5μMMMB,150ng/ml TSLP+1 μMMMB,共培养 2 天后,流式细胞术检测各组细胞CDllc+,CD80+,CD86+,MHCII+比值;并用实时定量PCR方法检测空白对照组,0μ MMMB 组(TSLP 组),0.5 μμMMMB 组(TSLP+MMB组)OX40L mRNA 含量。结果:培养第1天,镜下可见呈细砂样分布的圆形颗粒状;培养第3天,集落初步形成;培养第5天,集落进一步增大,增多,树枝样树突形成;培养第7天,呈半悬浮漂浮状,形状不规则,树枝样突起进一步增多,流式细胞术检测CD11C+细胞数可达到80%以上确认培养细胞为BMDCs。继续将BMDCs与TSLP和MMB共培养2天后,直至第9天时结果显示,0.1 μ M MMB组较0 μ M MMB组降低了 BMDCs表面CD86+含量;0.5,1μ MMMB组较0 μMMMB降低了CD80+,CD86+,MHCII 水平(P<0.05);且 0.1,0.5,1.0 μμMMMB 对 CDl1C+水平无影响。实时定量PCR方法示TSLP组较空白对照组OX40L mRNA含量明显升高,而TSLP+MMB组OX40L mRNA含量较TSLP组明显下降(P<0.05)。结论:1.实验第7天,培养细胞电子显微镜下形态及流式细胞术检测CD11C+细胞数80%以上可判定培养细胞为BMDCs。2.0.1,0.5,1.O μM MMB 可抑制 TSLP 诱导 BMDCs CD80+,CD86+,MHCII+表达,然而对CD11C+无影响。3.0.5 μ M MMB 可明显抑制 TSLP 诱导 BMDCs OX40L mRNA 含量。