Ure2淀粉样纤维的生物材料性质及应用研究——生物酶固定化展示和生物酶活性微凝胶制备

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天然存在的淀粉样纤维是一种由蛋白质自发组装形成的,高度有序的纤维状聚集体。从低等原核生物到高等哺乳动物中都存在淀粉样纤维,它不仅与哺乳动物的神经退行性疾病相关,而且也参与了生物体正常的生理功能。淀粉样纤维以cross-β结构为核心,以其结构稳定性等特性可以被应用为性质优良的生物纳米材料。  Ure2是酵母中的一种淀粉样蛋白,能够以其N端prion domain(PrD)形成淀粉样纤维,并将C端结构域展示在纤维核心表面。Ure2形成淀粉样纤维后,其C端结构域保持了本身的寡聚状态和酶活性,因此,Ure2是一个通过形成淀粉样纤维在纳米尺度上对酶进行固定化的模型。固定化酶因易于从反应体系中分离且可重复利用,在实际生产中有重要的应用价值。但常用的固定化酶方法却因酶易失活、固定化效率不高、制备步骤繁琐等问题限制了其应用。  选用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)和辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)这两个在寡聚组装形式和蛋白质折叠上与野生型Ure2 C端结构域有巨大差异的酶,尝试将Ure2 PrD开发成能够固定化展示广泛生物活性蛋白的骨架分子。结果显示,AP和HRP与Ure2 PrD在基因水平上融合表达后都能够通过PrD淀粉样纤维化而被固定化展示在纤维表面上,并且保持着较好的酶活性。同时,作为固定化酶,AP和HRP与Ure2 PrD的融合体纤维具有优良的稳定性和可重复利用性。通过将酶活性纤维制备成微型酶反应柱和蓝白斑筛选实验,我们不仅探索了Ure2 PrD淀粉样纤维固定化酶的潜在应用价值(如微量反应和高通量检测等),而且证明了淀粉样纤维固定化酶与已有的商业化酶相比,具有操作简便、可重复利用性好等特点,具有更好的实际应用表现。  微凝胶(microgel)作为一种微米尺寸的三维网状胶体颗粒,在生物,医学等领域有重要的应用价值。而目前常用于制备microgel的材料近乎全部为化学有机分子,且其制备条件中有许多都易导致生物体或者生物分子失活。基于利用淀粉样纤维进行酶固定化的研究,利用Ure2-AP和微流控(microfluidic)技术制备了尺寸均一的Ure2-AP droplets。Ure2-AP在droplet内高效地自发组装成了网状交错的纤维,使得droplet转变成microgel。制备的Ure2-AP microgel保持了较好的酶活性,且具有较好的microgel结构和性质。利用AP的荧光底物和易于实现微量和高通量操作的droplet trapping实验,实现了Ure2-APmicrogel酶活性的可视化,进一步展示了Ure2-AP microgel的潜在应用价值。  综上,将Ure2淀粉样纤维在纳米和微米尺度上开发成具有良好应用价值的生物材料,并且能够通过与各种蛋白质融合,方便地赋予其广泛种类的生物学活性。
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