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本研究以纯化的H1N1亚型猪流感病毒(Swine Influenza Virus,SIV)作抗原,按常规制取单克隆抗体的方法筛选到3株能稳定分泌抗体的杂交瘤,分别命名为ⅢF6A4C10,ID4A3D8,IC3H5H4。其中ⅢF6A4C10只与H1N1 SIV反应,不与H5N1AIV和重组的H1N1 SIV HA蛋白反应;ID4A3D8,IC3H5H4与H1Nl SIV、H5N1 AIV和重组的H1N1 SIV HA蛋白均有反应。亚型鉴定结果表明,ⅢF6A4C10的重链属于IgG1亚型,轻链为κ型;ID4A3D8重链属于IgG2a亚型,轻链为κ型;IC3H5H4重链属于IgG2b亚型,轻链为κ型。经间接ELISA测定,3株单抗效价为:细胞培养上清均为1:6,400,腹水均为1:12,800。单抗稳定性实验结果表明,3株单克隆抗体细胞的稳定性好。本实验将IgG1亚型单抗mF6A4C10、ⅢC2D1D4、IE6E4的腹水纯化以备用。
在本实验室建立C1q与抗原抗体复合物反应的C1q-ELISA方法的基础上,本研究从以下几个方面将C1q-ELISA方法进行了优化,包括酶标板、显色底物、抗体包被时间、C1q与抗原抗体复合物反应的温度和时间、C1q工作浓度、生物素标记抗人C1q和抗鼠C1q、绵羊抗人C1q与兔抗体绵羊IgG-HRP、SA-HRP稀释度。在优化的条件下,实验结果表明C1q-ELISA检测方法的灵敏度成功地提高至100-1,000 pg/mL。其中抗人TNFa单抗和抗人IL-1a单抗C1q-ELISA检测灵敏度达到100 pg/mt;抗人IL-4单抗C1q-ELISA检测灵敏度达到1,000 pg/mL。细胞培养上清的细胞因子检测实验结果表明,经Con A、Tsn刺激人辅助性T细胞产生含有人IL-4细胞因子的细胞培养上清分别稀释9倍、3倍时均能被抗人IL-4单抗有效检测出来。优化后的C1q-ElISA方法的检测灵敏度达到了皮克级,且成功运用优化的C1q-ELISA方法检测细胞培养上清中的细胞因子。
本研究还比较了人C1q和鼠C1q在结合鼠IgG方面的特性,发现差异显著:与5株鼠IgG1的结合结果表明,在鼠IgGl抗体低浓度(<1μg/mL)时,人C1q与鼠C1q均与之不结合;而在鼠IgG1抗体高浓度(>10μg/mL)时,人C1q与之结合较弱或几乎不结合,而鼠C1q则表现出很强的结合特性,与人C1q差异显著;与鼠IgG2a、IgG2b的结合实验结果表明,在鼠IgG2a和IgG2b抗体检测浓度中,人C1q、鼠C1q均能与之有效结合,但人C1q所表现出来的结合特性均明显强于鼠C1q。