致刺参腐皮综合征溶藻弧菌卵黄抗体的制备及活性研究

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刺参腐皮综合征因其传染性强、致死率高已成为公认的最为严重的疾病。而实际生产中主要依赖抗生素和化学药物来控制,但长此以往细菌耐药性会愈加严重,同时药物残留、生态环境失衡以及对人体健康的影响等诸多问题引起了国内外学者的广泛关注,开发绿色、安全且高效的抗生素替代品已迫在眉睫。为探究大连地区某刺参养殖场刺参溃烂死亡的病因,本研究从患病刺参病灶处分离出一株优势菌株AP-1,经形态学观察、16S rRNA序列分析及生理生化鉴定,确定其为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)。人工回接感染试验结果显示除浸浴感染未出现病变症状外,其它2种攻毒方式均呈现不同程度的剂量依赖性致死,且体壁创伤浸浴攻毒的半数致死浓度为5.23×106 CFU/mL,腹腔注射攻毒的半数致死量为3.08×104 CFU/g。此外,对其毒力相关基因进行PCR检测,发现其携带有toxR、FlaA、Collagenase、fur、Asp A、ompW和tlh 7种毒力相关基因。药敏结果表明,该菌对氨苄西林、哌拉西林、奥格门汀、头孢唑林、头孢噻肟及阿米卡星6种抗生素耐药;对其它受试抗生素处于中介或敏感。以灭活的溶藻弧菌为抗原制备卵黄抗体,通过水稀释—冻融—盐析—超滤浓缩法对蛋黄分离纯化,其纯度可达到90.13%。酶联免疫吸附实验测得其抗体的最高效价为1:64000,可持续2周,水溶性组分溶液中的总IgY含量基本都保持在1.6 mg/mL左右,特异性IgY的含量最高值达到0.256±0.032 mg/mL,占总IgY的比例为16.06%。免疫荧光电镜和透射电镜实验结果显示,IgY能够与溶藻弧菌AP-1的发生特异性结合,并使细菌发生凝集。体外抑菌生长实验发现特异性IgY能显著抑制细菌的生长,细菌活性检测实验表明其活性降低,且病原菌的内部结构显示,菌体出现表面模糊,胞质空泡化程度加大等现象。结晶紫染色法和微生物碳氢吸附能力实验表明,特异性IgY能够减少溶藻弧菌生物被膜的形成,增强细菌表面的疏水性。动物实验中,腹腔攻毒后注射IgY、浸浴IgY后体壁创伤浸浴攻毒两种方式均可以显著提高感染刺参的存活率,表明特异性IgY能够对刺参起到良好的保护效果。酶联免疫吸附实验显示,健康刺参浸浴IgY后,其体腔液中在24 h后仍具有IgY活性;免疫荧光实验显示IgY在呼吸树上有分布,推测呼吸树为IgY由海水进入体腔液及其它组织内的途径之一。综上,本研究以分离获得的溶藻弧菌AP-1为抗原制备的卵黄抗体对感染刺参具有良好的保护效果,可为IgY抑菌机制的深入研究及刺参的病害防治提供一定的科学依据和参考。
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