第一部分，IGFBP7基因慢病毒载体的构建及其在K562细胞的表达　　 目的：构建IGFBP7（insulin-like growth factor binding protein 7）基因的慢病毒载体，为研究该基因在白血病中的功能提供基础。　　 方法：采用限制性内切酶酶切获得目的基因，基因重组构建慢病毒载体质粒venus-/GFBP7，用293T细胞包装慢病毒颗粒感染K562细胞，并采用多种方法鉴定。　　 结果：所获IGFBP7基因经测序与GenBank比对序列一致。慢病毒载体质粒venus-/GFBP7经BamH1酶切鉴定片段大小正确。荧光显微镜及流式细胞仪检测到GFP在293T及K562细胞中表达，RT-PCR和Western blot检测到IGFBP7在K562细胞表达。　　 结论：本课题成功构建带有IGFBP7基因的慢病毒载体，为研究IGFBP7基因在K562细胞中的功能奠定了基础。　　 第二部分，IGFBP7基因在K562细胞中的生物学功能研究　　 目的：通过成功构建IGFBP7-K562细胞稳定表达株，观察IGFBP7基因对白血病细胞株K562细胞增殖、细胞周期、穿膜等生物学行为的影响，初步探讨IGFBP7基因在AML中的生物学功能。　　 方法：通过CCK-8法及细胞集落实验观察IGFBP7对细胞增殖的影响。利用ELISA方法检测稳定转染株培养上清中IGBP7的表达及观察上述细胞培养上清对未转染K562细胞增殖的影响。通过流式分析细胞周期的变化及利用RT-PCR方法和Western Blot方法检测cyclinD1的表达。通过穿膜实验检测IGFBP7基因对K562细胞穿膜能力的影响。　　 结果：通过CCK-8检测发现在第二天IGFBP7转染株相对于空载体载体转染组明显升高（升高23％），集落形成数量及大小IGFBP7转染组也明显高于空载体组(39±4vs26±6，P＜0.05)。ELISA检测发现IGFBP7转染株组细胞培养上清中IGFBP7表达水平明显高于空载体组及阴性对照组（76.37±2.19μg/Lvs63.52±2.29μg/Land60.31±0.24μg/L，P=0.0001），而且该培养上清具有促进未转染K562细胞增殖的能力（IGFBP7转染株上清组VS空载体转染株上清组：140%上升；d2;P＜0.05）。IGFBP7转染株组细胞周期G0/G1期比例下降至35.34%±3.36%，而S期升至56.08%±1.85%，相对空载体转染组具有明显意义(P＜0.05)，同时cyclinDlmRNA水平及蛋白水平在IGFBP7转染组均是升高的。细胞穿膜实验表明IGFBP7转染株组穿膜能力较对照组（空载体组及未转染细胞组）明显升高(18080±630vs4250±653vs5388±855;P＜0.05)。　　 结论：IGFBP7基因具有促进细胞的增殖、周期进展及穿膜能力，从而产生癌基因样作用。　　 第三部分，IGFBP7基因在K562细胞中分子机制探讨　　 目的：为了进一步明确IGFBP7在K562细胞中引起的一系列生物学功能变化的具体分子机制，我们通过基因芯片及western blot方法，从基因组与蛋白组水平来探索的该基因分子效应作用机制。　　 方法：通过基因芯片技术筛选出IGFBP7转染株与空载体转染株差异表达基因，利用定量PCR及western blot技术进一步验证。定量PCR法检测IGFBP7和AKT3基因在40例初诊急性髓细胞白血病的表达情况，通过相关性分析两基因间的相关性。通过小分子抑制剂进一步观察细胞生物学特征的改变。　　 结果：基因芯片筛选出10个差异表达基因进行定量PCR验证，其中包括AKT3，结果发现芯片结果与定量PCR结果趋势完全一致，证实了我们芯片结果的可靠性。同样在IGFBP7转染株组中AKT3总蛋白表达水平及磷酸化水平亦升高。IGFBP7和AKT3基因在40例初诊急性髓细胞白血病患者中表达量具有明显相关性(r=0.505，P=0.001)。利用AKT抑制剂(triciribine)作用转染株后，发现细胞增殖、细胞周期进展及穿膜能力均明显受到抑制，而且AKT3磷酸化水平也明显下降，所以我们认为IGFBP7在K562细胞中通过活化AKT信号通路引起了细胞增殖、细胞周期及穿膜能力的变化。　　 结论：IGFBP7基因在AML中通过AKT信号通路引起了细胞增殖、细胞周期及穿膜能力的变化。