研究背景： 急性肺损伤(acute lung injury,ALI)，严重时称之为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，是因急性肺水肿和炎症导致的特殊类型呼吸衰竭综合征，与多种致病因素如肺炎、败血症、急性胰腺炎、药物过量服用等有关。临床表现为顽固性低氧血症、呼吸频数和呼吸窘迫，胸部x线显示双肺弥漫性浸润影，后期多并发多器官功能障碍[1]。ALI/MARDS的死亡率很高，到目前为止，仍然没有治疗AU并BARDS的特效药物，因此探索治疗新靶点，寻找和开发ARDS治疗新药是研究者的目标。 近来环磷酸腺苷(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP)通过对炎症细胞及免疫细胞的调节参与ALI/MARDS的发病过程越来越受到重视。cAMP和cGMP是细胞内重要的第二信使，与特异性蛋白激酶结合后导致各种底物磷酸化，调节体内的各种病理生理过程。PDE是细胞内降解环核苷酸的唯一途径，对调节这类第二信使的细胞内水平起关键作用。cAMP可抑制免疫和炎症细胞的多种功能，在这些细胞中cAMP-特异性的PDFA是主要的PDE形式，PDE4抑制剂能增加cAMP的水平，且在各种动物模型中表现出抗炎作用[2]。 本实验探讨经典的PDE4抑制剂咯利普兰(Rolipram，ROL)和新型PDE4抑制剂ZL-n-91.对小鼠内毒素性肺损伤的改善作用，并进一步探索其作用机制。 目的： 研究经典PDE4抑制剂咯利普兰和新型PDE4抑制剂ZL-n-91.对小鼠内毒素性肺损伤的改善作用及机制。 方法： 一、咯利普兰对小鼠急性肺损伤的改善作用 脂多糖(LPS)3.0 mg·kg-1气管内滴入诱导小鼠急性肺损伤。设正常对照组、模型组、咯利普兰(0.1 mg,0.3 mg和1.0mg·kg-1，ip)组和地塞米松(0.5 mg·kg-1，ip)组，给药6h后处死小鼠。常规细胞形态学方法检测支气管肺泡灌洗液(BAI F)中性粒细胞数目，观察肺湿重／干重(W／D)比值和肺组织病理的改变，考马斯亮兰法测定BALF中总蛋白含量，髓过氧化物酶(MPO)活性测定试剂盒测定肺组织匀浆中MPO活性，ELISA法测定肺组织匀浆中肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量，高效液相层析(HPIC)法测定肺组织匀浆中环腺苷酸磷酸二酯酶(cAMP-PDE)和磷酸二酯酶4(PDE4)活性。 二、新药ZL-n-91对小鼠急性肺损伤的改善作用 脂多糖(LPS)3mg·kg-1气管内滴入诱导小鼠急性肺损伤。设正常对照组、模型组、新型PDE4抑制剂zL广n-91(0.3μg，1.0μg，3.0μg·kg-1，ip)组、地塞米松(0.5mg·kg-1，ip)组、经典PDFA抑制剂咯利普兰(1.0mg·kg-1，ip)组。常规细胞形态学方法检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中性粒细胞数目，观察肺湿重／干重(W／D)比值和肺组织病理的改变，考马斯亮兰法测定BALF中总蛋白含量，髓过氧化物酶(MPO)活性测定试剂盒测定肺组织匀浆中MPO活性，ELISA法测定肺组织匀浆中肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量，高效液相层析(HPLC)法测定肺组织匀浆中环腺苷酸磷酸二酯酶(cAMP-PDE)和磷酸二酯酶4(PDE4)活性，血气分析测定动脉血氧分压(medal partial pressure 0f oxygen，PaO2)、动脉血二氧化碳分压(arterialpartial pressure of carbon dioxide，PaCO2)、动脉血PH值等指标，采用Robichaud A[3]等的方法，观察并记录各用药组对其麻醉作用持续时间即翻正反射恢复时间的影响，来评价ZL-n-91的致呕反应。 结果： 一、咯利普兰对小鼠急性肺损伤的改善作用 小鼠气道内滴入LPS 6 h后，：BALF中的白细胞总数和中性粒细胞数目迅速上升，与对照组比较分别增加了3.2倍和10.9倍(P＜0.01)；模型组肺湿重／干重(W／D)比值明显升高(P＜0.01)；肺组织病理切片可见肺血管、气道周围有大量中性粒细胞浸润；BALF中蛋白含量明显升高，与对照组比较增加了1.5倍(P＜0.01)；肺组织匀浆MPO活性和TNF-α含量显著增加，与对照组比较分别增加了1.7倍和2.0倍(P＜0.01)；肺组织中cAMP-PDE及PDE4的活性明显升高，与对照组比较分别增加了3.4.倍和3.0倍(P＜0.01)。腹腔注射ROL(0.1 mg,0.3 mg和1.0 mg·kg-1)能够剂量依赖性的降低BALF中白细胞及中性粒细胞的数目(P＜0.05)；ROL，(0.1 mg，0.3 mg和1.0 mg·kg-1)可降低ALI小鼠肺湿重／干重(W／D)比值，0.3 mg·k-1与模型组相比即有显著性差异(P＜0.01)；ROL各组肺病变均较模型组减轻，气道周围及肺组织间隙中性粒细胞明显减少，肺水肿明显减轻；ROL，各组BALF中蛋白明显减少，1.0 mg·k-1即能显著降低BALF中蛋白含量(P＜0.01)；ROL能显著降低MPO水平，0.3 mg·kg-1即有显著性差异(P＜0.01)，呈剂量依赖性降低TNF-α水平(P＜0.05)；ROI，可以抑制肺组织中cAMP-PDE及PDE4的活性的升高，0.3 mg·kg-1能显著抑制cAMP-PDE的活性(P＜0.01)，1.0 mg．kg-1能显著抑制PDE4的活性(P＜0.01)。 二、新药ZL-n-91对小鼠急性肺损伤的改善作用 小鼠气道内滴入LPS 6 h后，BALF中的白细胞总数和中性粒细胞数目迅速上升，与对照组比较分别增加了2.86倍和6.16倍(P＜0.01)；模型组肺湿重／干重(W／D)比值明显升高(P＜0.01)；肺组织病理切片可见肺血管、气道周围有大量中性粒细胞浸润；BALF中蛋白含量明显升高，与对照组比较增加了1.35倍(P＜0.01)；肺组织匀浆MPO活性和TNF-α含量显著增加，与对照组比较分别增加了1.51倍和2.23倍(P＜0.01)；肺组织中cAMP-PDE及PDE4的活性明显升高，与对照组比较分别增加了2.77倍和1.95倍(P＜0.01)；模型组小鼠外周血动脉血PH值、动脉血氧分压(arterial partial pressure of oxygen，PaO2)、动脉血二氧化碳分压(arterial partial pressure of carbon dioxide，PaCO2)等各项指标较正常对照组有明显变化，其中PH值和PaO2较正常组有显著下降，但在统计学上无显著性差异，PaCO2方面，模型组较正常组有显著上升，在统计学上有显著性差异CP＜0.01)；腹腔注射ZL-n-91(0.3μg，1.0μg，3.0μg·kg-1)能够剂量依赖性的降低BALF中白细胞及中性粒细胞的数目(P＜0.05)；ZL-n-91各剂量组能明显降低肺W/D比值，但与模型组相比无显著性差异，ROL和DXM能显著降低肺W／D比值(P＜0.05)；ZL-n-91各组肺病变均较模型组减轻，气道周围及肺组织间隙中性粒细胞明显减少，肺水肿明显减轻；ZL-n-91各剂量组显著降低BALF中蛋白，ZL-n-91 0.3μg·k-1即有显著性差异(P＜0.05)；ZL-n-91.0.3μg，1.0μg和3.0 μg·kg-1各剂量组呈剂量依赖性的降低肺组织中MPO活性，同时也能显著降低TNF-α水平；ZL-n-91各剂量组与模型组相比cAMP-PDE及PDE4活性明显降低，但ZL-n-910.3μg．kg-1与模型组相比无显著性差异，ZL-n-91 0.3μg·kg-1，1.0μg·kg-1与模型组相比有显著性差异(P＜0.05)；血气方面：ZL-n-91各剂量组及ROL组、DXM组PH均有明显下降，与模型组相比无显著性差异，但与正常组比较均存在显著性差异(P＜0.05)，各PDE4抑制剂组PaO2有所改善，以ZLn-91高剂量和ROL为显著，但与模型组及正常组比较，均无显著性差异，ZL-n-91低、中剂量组对PaCO2改善作用不明显，ZL-n-91高剂量和ROL改善作用显著，但与模型组及正常组比较，均无显著性差异。而DXM对PaCO2和PaO2方面作用不明显；溶媒对照组与生理盐水对照组比较，翻正反射的恢复时间无明显差异，ZL-n-9各组用药后翻正反射的恢复时间明显缩短，低剂量组与对照组比较无显著性差异，中剂量组和高剂量组与溶媒对照组相比出现显著性差异(P＜0.01)。但高剂量组翻正反射的恢复时间又有延长，ROL组与高剂量组时间相当，而DXM与生理盐水对照组也相当。 结论： 综上结果表明，ROL和新药ZL-n-91都能通过减少蛋白渗出及肺水含量，抑制肺组织中性粒细胞浸润，降低肺组织MPO和TNF-α水平，抑制PDE4的活性等方面改善LPS诱导的小鼠急性肺损伤的作用，同时ZL-n-91还能明显改善LPS诱导的小鼠动脉血氧分压下降，对LPS诱导小鼠ALI具有改善作用。该改善作用可能与抑制PDE4活性、抑制中性粒细胞黏附和趋化及降低TNF-α水平有关。但翻正反射表明ZL-n-91的中枢作用可能较ROL更强。所以新药ZL-n-91在治疗ALI和ARDS方面有待于进一步研究。