背景:　　铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种临床常见机会致病菌，常引起免疫力低下患者慢性感染。β-内酰胺类抗生素是其临床常用的治疗药物。但由于长期以来抗生素的滥用和不合理使用，导致致病菌的耐药性越来越严重。β-内酰胺类抗生素抗菌谱内的多数细菌，包括铜绿假单胞菌，对β-内酰胺类抗生素的抗性有80％是由细菌产生的β-内酰胺酶所致。对于细菌研究较多的β-内酰胺酶是AmpC产酶系统，尤其是其调节基因ampR，ampD的突变对产酶系统的影响，而对另一种重要的调节基因ampG则研究较少。ampG存在于大多数革兰阴性细菌，其编码产物为AmpG蛋白。AmpG蛋白作为膜通道蛋白参与细菌细胞壁肽聚糖的循环，当有β-内酰胺类抗生素存在于周围环境时，它就具有重要的信号转导功能，在细菌诱导表达AmpCβ-内酰胺酶的过程中起到重要作用。将铜绿假单胞菌PAO1的ampG基因敲除后，可以阻断其β-内酰胺酶的诱导性，从而提高细菌对β-内酰胺类抗生素的敏感性。质子势能抑制剂羰基氰氯苯腙(CCCP)也可以通过阻断AmpG的能量来源而抑制其活性，从而提高PAO1对β-内酰胺类抗生素的敏感性。　　目的:　　本文在现有对ampG基因研究的基础上，先以NCBI数据库中PAO1的ampG基因为参考序列，结合本研究从收集到的211株不同氨苄西林抗性的铜绿假单胞菌内根据设定条件选取的60株ampG基因的测序结果，分析该基因在不同氨苄西林抗性的铜绿假单胞菌中的多态性;以敲除ampG基因后的铜绿假单胞菌为受体，进行遗传互补实验，探讨不同氨苄西林抗性的ampG基因对糖肽的转运效率的影响，研究野生型铜绿假单胞菌中ampG基因的结构对耐药的影响;对PAO1的ampG基因进行定点突变，研究AmpG的结构和功能关系;鉴于CCCP对AmpG的抑制作用，我们收集了数种外排泵抑制剂及其临床来源的类似药物90种，检测它们与氨苄西林联合使用对PAO1的抑菌效果，探索是否有与CCCP功能相似的药物;之后将一株表现为多重耐药的铜绿假单胞菌PA1280的ampG基因进行敲除及回补，进一步研究ampG基因对野生型铜绿假单胞菌耐药的影响，探索铜绿假单胞菌的耐药机制，并为筛选和合成抑制AmpG功能的药物奠定实验基础。　　方法:　　1、收集温州医科大学第一附属医院2009年至2013年从临床标本分离到的铜绿假单胞菌211株，并对其进行氨苄西林药敏测定。根据药敏结果人为分为氨苄西林低抗(MIC≤512μg/ml)、中抗(512μg/ml＜MIC＜4096μg/ml)和高抗(MIC≥4096μg/ml)三个梯度;　　2、分别从三个梯度中各挑取20株提取基因组，并用ampG基因全长引物进行PCR扩增并克隆，将克隆送测验证;以NCBI数据库搜索到的铜绿假单胞菌PAO1的ampG序列为参考序列，用BioEdit软件将测序成功的序列进行比对;　　3、以敲除ampG基因的铜绿假单胞菌PAO1△G为受体菌，进行克隆ampG基因的回补实验;　　4、测定回补菌株的氨苄西林抗性水平，分析具有SNP位点的ampG基因的转运糖肽的效率，进行铜绿假单胞菌ampG基因的结构与功能关系的研究;　　5、将PAO1的ampG基因进行定点突变，研究铜绿假单胞菌中该基因的结构与功能的关系:　　6、检测CCCP与部分抗生素联用对25株临床分离铜绿假单胞菌的抑菌效果，研究CCCP对野生型铜绿假单胞菌的作用;　　7、检测90种临床来源药物与氨苄西林联合使用后对PAO1的抑菌效果;　　8、用同源重组法将表现为多重耐药的野生型铜绿假单胞菌PA1280的ampG基因进行敲除，构建敲除株PA1280△G，研究ampG基凶在野生型铜绿假单胞菌耐药中的作用;　　9、以PA1280△G为受体，分别用PAO1和PA1280的ampG基因进行回补，并检测敲除株和回补株对各抗生素的MIC。　　结果:　　1、根据琼脂稀释法测得的氨苄西林MIC结果，211株铜绿假单胞菌被分为氨苄西林低抗(MIC≤512μg/ml)、中抗(512μg/ml＜MIC＜4096μg/ml)和高抗（MIC≥4096μg/ml）三个梯度，其中低抗组44株、中抗76株、高抗91株。　　2、提取60株基因组进行ampG基因的克隆，将克隆送测序，测序成功59株;　　3、用BioEdit软件将59条测序成功的序列与参考序列进行比对，发现有36株在58个位点上发生了96次碱基置换，其中C-T间的转换占50％（48次），G-A间的转换为25％（24次），余为碱基颠换。在发生的58个点突变中，有10个引起了氨基酸的改变;　　4、挑取36条测序成功的ampG序列构建表达载体，以PAO1△G为受体进行回补实验，重组子氨苄西林的MIC基本上稳定在512μg/ml;　　5、将保守性氨基酸I53、W90这2个位点进行了定点突变研究后，遗传回补实验结果显示与PAO1相比，I53位点异亮氨酸-丝氨酸和异亮氨酸-苏氨酸的突变体对氨苄西林的MIC及其β-内酰胺酶活性明显下降，说明该位点氨基酸的突变可能造成了ampG基因转录异常或AmpG蛋白构象的异常，从而抑制了其转运底物的活性;　　6、将CCCP分别与美罗培南、氨苄西林、氯霉素和四环素联合使用，检测了包括PAO1在内的25株野生型铜绿假单胞菌的M1C。有8株原本对美罗培南耐药的表现为敏感，有4株仍为耐药;对于氨苄西林则有15株由耐药转为敏感;氯霉素也有16株由耐药转为敏感;CCCP对四环素的作用最小;无论哪种药物，PAO1的MIC改变都不显著;　　7、将包括外排泵抑制剂及其相似物在内的90种临床来源药物与氨苄西林联合使用，检测其对PAO1的抑菌效果，发现有19种药物可以与氨苄西林产生协同作用，包括14种抗生素和5种非抗生素类临床用药。但同CCCP一样，临床药物来源类的常规外排泵抑制剂与氨苄西林联用对PAO1没有明显的协同作用;　　8、将野生型铜绿假单胞菌PA1280的ampG基因敲除后，其氨苄西林抗性由＞8192μg/ml降至4100μg/ml，虽然效果显著，但不能完全阻断对氨苄西林的抗性，且对其它抗生素的影响也微乎其微。另外，与PAO1△G不同，敲除ampG基因的PA1280仍然具有β-内酰胺酶的诱导性。分别用PA01及其自身的ampG基因回补后，可以完全重建野生型的耐药水平。同样，CCCP可以明显提高PA1280的野生型及重组子对部分抗生素的敏感性。　　结论:　　铜绿假单胞菌ampG基因的自发突变率较高，但引起氨基酸改变的并不多，均可编码有功能的AmpG，可知铜绿假单胞菌的ampG基因保守性较高;CCCP可以显著提升部分抗生素对铜绿假单胞菌的抗菌活性;虽然对PA01的作用并不明显，但一部分临床用药可以显著增强氨苄西林对PA01的抑菌活性，机制尚不清楚。从回补药敏结果可知，ampG能表达功能性AmpG是细菌维持肽聚糖循环和产生对β-内酰胺类抗生素耐药的基础;对于野生型铜绿假单胞菌来说，虽然ampG失活后可以引起氨苄西林抗性的明显下降，但对其他β-内酰胺类抗生素的作用似乎并不显著;而且，即使敲除了ampG基因，野生型铜绿假单胞菌仍有可能具有β-内酰胺酶的诱导性，说明其耐药机制更为复杂。