对羟基苯甲酸酯简称4HBA酯,是广泛应用于食品、化妆品、化工等的防腐剂。同山梨酸、苯甲酸等传统防腐剂相比,其抗菌性更强,安全性更高。2006年,我们研究组发现了微泡菌Microbulbifer sp.A4B-17菌株可以合成并积累4HBA酯类等次级代谢产物。和其他细菌相比,其合成量较高,且不被降解。目前,4HBA酯类是利用4HBA和醇类合成而得。而4HBA是由苯化学合成,此过程高能耗,高污染,低产量,且有苯酚的生成,严重危害人类的生存环境。所以,探索出一条既能大量生产4HBA酯类,又能在资源匮乏,环境污染严重的现代社会节约能源,保护环境的道路至关重要。依赖于微泡菌Microbulbifer sp.A4B-17菌株的这一特性,我们试图探索合适的生物方法,将该菌株改造成一个工业菌株。在对A4B-17菌株的4HBA酯类合成途径分析时我们发现了一个关键基因GM001349,猜测它可能是编码催化醇类和4HBA进行反应生成4HBA酯类的羧酸酯酶基因。本研究首先对GM001349基因进行分析,利用无缝克隆的方法构建基因表达载体,转化到大肠杆菌中进行异源表达,超声波破碎提取其中的粗酶,由于目的蛋白上带有组氨酸标签,利用镍柱进行纯化得到蛋白大小为57.60 KDa的羧酸酯酶。研究发现该羧酸酯酶能够催化4HBA酯类的合成与水解反应,在弱酸性环境下,它能催化4HBA和醇合成相应的4HBA酯的反应,在弱碱性环境下,它能催化4HBA酯水解为4HBA和相应的醇的反应。35℃是此酶的最适温度,且一定的蛋白酶抑制剂和金属离子都有利于酶促反应的进行。米氏方程表示酶促反应速率与底物浓度关系,通过绘制Lineweaver-Burk曲线计算出此酶的米氏常数(Km),在研究的范围内发现,分别以4HBA,甲醇,乙醇,丙醇,丁醇,庚醇,壬醇,4HBA甲酯为底物,它们的Km值分别为0.43±0.042 mmol/l,0.42±0.037 mmol/l,1.81±0.586 mmol/l,8.46±5.284 mmol/l,2.86±0.830 mmol/l,2.60±0.333 mmol/l,2.98±0.899 mmol/l,5.68±0.828 mmol/l,其中以甲醇为底物时,其Km值最小,是此酶的最适底物。综上所述,GM001349编码的羧酸酯酶具有催化4HBA酯合成的活性,奠定了Microbulbifer sp.A4B-17菌株大量合成4HBA酯的“工业菌株”的基础。