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猪胚胎工程在畜牧业、医学、生物学基础研究等方面均具有重要的科学意义和广阔的应用前景。但作为影响猪胚胎早期发育效率与质量的关键环节之一,猪胚胎体外培养体系仍然不理想。已知作为TGF-P超家族的一员,卵泡抑素(Follistatin, FST)可有效地促进牛和猴子早期胚胎的发育。然而FST对猪早期胚胎发育是否有作用鲜有报道。为了深入探讨FST对猪早期胚胎体外发育的影响,完善猪胚胎体外培养方案,本研究开展了如下试验：试验一：为了探明FST对体外胚胎形成可能的分子机制,我们检测了猪卵母细胞和不同发育阶段的猪孤雌激活胚(parthenogenetic activation embryo, PAE)>体外受精胚(in vitro fertilization embyo, IVFE)中 FST mRNA的表达丰度及其蛋白的动态表达模式。实时荧光定量PCR (Real-time Quantitative PCR, RT-qPCR)结果显示,猪卵母细胞和早期胚胎的各个发育阶段均有FST mRNA的表达。FST mRNA随着成熟时间的延长而缓慢上升,在PAEs和IVFEs的2、4和8-cell阶段表达丰度显著下降,而到了囊胚期,胚胎中FST mRNA表达丰度又明显上升。间接免疫荧光染色结果显示,FST蛋白从受精(或激活)后开始显著上升,并在4-cell期达到峰值,之后随着胚胎发育的进行而显著下降,整体表现为先上升后下降的趋势。结果表明,猪卵母细胞及早期胚胎中均有FST mRNA及其蛋白表达,说明FST对卵泡发育和早期胚胎发育可能有影响。试验二：为揭示不同亚型的FST蛋白对猪PAEs早期胚胎着床前体外发育的影响,我们将PAEs随机置于分别添加10ng/mL FST-288、FST-300、FST-315蛋白的PZM-3培养基中培养,以不加任何FST的PZM-3为对照组。结果发现,卵裂率方面,与对照组相比,添加FST-300能显著提高猪PAEs早期卵裂率和总卵裂率(P<0.05)；而添加FST-315虽然也能显著提高总卵裂率,但早期卵裂率提高不显著。囊胚形成方面,不管是全程添加还是半程添加,添加FST-300均能显著提高胚胎的囊胚率(P<0.05),添加FST-315也能改善囊胚形成率,但差异不显著。在囊胚质量方面,除了全程添加FST-315组的ICM细胞数显著下降外,其他组之间都未见明显改变。结果表明,添加10ng/mL的FST-300能显著促进初次卵裂时间的提前及囊胚形成率的提高,但对囊胚质量无明显影响。试验三：为进一步阐明FST-315蛋白对猪早期胚胎着床前体外发育的影响,同时研究FST对不同类型的胚胎其作用是否一致,我们分别在PAEs和核移植胚(nuclear transfer embryo, NTE)的体外培养过程中,在PZM-3中全程添加0(对照组)、1、10、 100ng/mL的FST-315蛋白,通过监测卵裂率、囊胚率和囊胚质量来评价其作用效果。结果显示,不管是PAEs还是NTEs,各组之间的卵裂率和囊胚形成率均无显著差异,但1ng/mL组囊胚总细胞数和TE细胞数显著高于对照组。有趣的是,添加1ng/mLFST-315能显著提高NTEs的早期卵裂率,但对PAEs并没有明显影响。结果表明,添加FST-315对猪早期胚胎发育有影响,主要表现在影响其囊胚质量。试验四：为探讨不同浓度FST-300蛋白对猪NTEs胚胎着床前体外发育的影响,我们在PZM-3中全程添加5、10、20ng/mL的FST-300蛋白,不加FST-300的PZM-3为对照组,通过采集卵裂率、囊胚率和囊胚总细胞数来评价其培养效果。结果发现,相对于对照组,各组的早期卵裂率、总卵裂率以及囊胚总细胞数、ICM细胞数和TE细胞数并未显著改变。但20ng/mL组能显著提高其囊胚率,虽然5ng/mL和10ng/mL组也能提高其囊胚率,但差异不显著。结果表明,10ng/mL的添加浓度并不是FST-300在猪核移植胚胎体外培养过程中的最适浓度,需要适当提高。试验五：为揭示不同FST-300处理时间对猪NTEs胚胎发育的影响,我们在胚胎体外培养的前30h、48h和60h添加10ng/mL FST-300蛋白进行处理,之后转移到未添加FST-300的培养基中进行培养,设立全程未添加组为对照,比较其对NTEs胚胎发育的影响。结果发现,不管在最初胚胎培养的什么时间(如30h、48h和60h)添加10ng/mL FST-300,囊胚率均显著高于对照组,但各组之间的囊胚细胞数、ICM细胞数和TE细胞数差异不显著。结果暗示,FST-300对于猪早期胚胎发育的影响,主要发生在胚胎基因组激活之前。综上所述,本研究首次揭示了猪卵母细胞和不同发育阶段的PAEs和IVFEs中FST mRNA的表达丰度及蛋白的动态表达模式。在促进猪着床前胚胎体外培养方面,不管是PAEs还是NTEs,以20ng/mL FST-300蛋白至少处理30h在囊胚形成率方面效果最好,而以1ng/mL FST-315处理在提高囊胚质量方面效果最好。总之,本研究首次证实FST对猪早期胚胎的发育有一定的促进作用,但这种促进作用因FST的亚型不同而异。FST-300能促进初次卵裂时间的提前及囊胚形成率的提高,FST-315能提高囊胚质量。