紫花苜蓿根际氢氧化细菌的分离鉴定及促生机制研究

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为进一步筛选对植物生长具有明显促进作用的氢氧化细菌,逐步开发微生物肥料以促进农业的可持续发展。本研究以陕西地区不含吸氢酶的结瘤豆科植物紫花苜蓿(Medicago sativa)根际为研究材料,逐步完善氢氧化细菌的分离、培养技术;深入了解其生理生化特性,并进行鉴定,丰富现有的基于氢氧化细菌的种属分类地位的研究;探索其促进植物生长的作用机制,主要内容和结果如下:利用持续通H2的气体循环培养体系,以电解水的方式产生H2,与通入的空气混合,形成流速为280 mL/min,含H2量为4.16×10-4-2.42×10-3 mol/L的混合气体,富集土壤中的氢氧化细菌,富集的土壤样品经矿质盐固体培养基培养,共分离纯化出37株细菌。气相色谱测定菌株的氧化H2能力,结果显示有8株菌的吸氢值大于2.44×10-4mol/L,占测定菌株总数的25.93%,初步确定为氢氧化细菌。其中菌株WMQ-7和FMG-5的吸氢值大于12.28×10-4mol/L,而菌株WMQ-7的氧化氢能力最强,达19.90×10-4mol/L。通过对8株氢氧化细菌的形态观察和生理生化实验,初步鉴定其分属于邻单胞菌属(Plesiomonas)、脂肪杆菌属(Pimelobacte)、假单胞菌属(Pseudomonas)、黄色杆菌属(Xanthobacter)、勒米诺氏菌属(Leminorella)、地杆菌属(Terrabacter)和稀有杆菌属(Rarobacter)。同时检测了菌株WMQ-7的最适培养条件:最适碳源葡萄糖、最适温度30℃、最适pH 7.0。对8株氢氧化细菌进行了小麦促生实验,平板检测结果显示:菌株WMQ-7、FMG-3、FMG-5对小麦的促生作用表现极为显著,根长与空白对照相比分别增加了73.92%、74.78%、58.26%;苗长比空白对照增加34.64%以上,其中菌株FMG-3处理的小麦苗增加了67.64%;小麦种子的根上部分干重平均值比空白对照分别增加95.24%、57.14%、47.62%。菌株FMG-5、WMQ-7、FMG-3处理的盆栽小麦在成熟后小麦麦粒数分别比对照多1倍以上。菌株WMQ-7、FMG-5、FMG-3处理的小麦,结穗收获后制粉,面粉中的还原糖、总糖含量、蛋白质含量都比对照有不同程度的提高,其中菌株FMG-3处理的小麦还原糖含量比对照提高了23.76%,总糖含量比对照提高7.38%。而菌株FMG-5对小麦蛋白质含量的影响最为显著,蛋白质含量比对照提高了22.86%。从ACC脱氨酶和铁载体两个方面探索氢氧化细菌促进小麦生长的作用机制。利用薄层层析法筛选出一株ACC脱氨酶阳性菌株WMQ-7,茚三酮比色法检测该菌株ACC脱氨酶活力为0.671 U/μg。利用MSA-CAS和MKB-CAS检测平板,通过培养基颜色的变化筛选产铁载体的阳性菌株。菌株WMQ-7在MSA-CAS检测平板上,菌落周围蓝色培养基变成粉色,而在MKB-CAS检测平板上,菌落周围蓝色培养基变成黄色,说明该菌株能够分泌产生铁载体。利用紫外分光光度计检测铁载体,结果显示菌株WMQ-7分泌的铁载体在404 nm处有明显的吸收峰,吸光值为0.834。与标准品2,3-DHBA的波长扫描图对照显示,菌株WMQ-7分泌的铁载体类型不是儿茶酚型。通过邻菲啰啉检测法,间接推算出菌株WMQ-7分泌产生的铁载体的量为7.1996μg/mL。对菌株WMQ-7、FMG-3、FMG-5的16S rDNA序列进行分析并构建系统发育树,结果表明,氢氧化细菌在亲缘关系上存在较大差异,遗传距离较远。其中,菌株WMQ-7的16S rDNA序列长度为1451 bp,GC含量为53.8%,与恶臭假单胞菌的同源性为99%,结合菌体形态和生理生化特性,进一步鉴定菌株WMQ-7为恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)(GenBank登录号为EU807744)。菌株FMG-3、FMG-5的16S rDNA序列长度分别为1034 bp、1394 bp;GC含量分别为51.7%、54.45%。菌株FMG-5与根瘤菌相似性在94%,而菌株FMG-3的16S rDNA序列在GenBank中没有找到可以比对的序列,在系统发育树中单独作为一个分支,推测菌株FMG-3很可能是一个新种。
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